Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chi42 vào cây lạc (Arachis hypogaea L.) qua trung gian Agrobacterium tumefaciens

Trong nghiên cứu này, lá mầm chứa phôi của cây lạc được sử dụng làm mẫu vật chuyển gen từ chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang vector pMVY719/chi42. Sự tích hợp gen chuyển vào bộ gen cây lạc được đánh giá bằng PCR.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chi42 vào cây lạc (Arachis hypogaea L.) qua trung gian Agrobacterium tumefaciensTẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 22, Số 2 (2023) KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CHUYỂN GEN Chi42 VÀO CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) QUA TRUNG GIAN Agrobacterium tumefaciens Nguyễn Hoàng Tuệ1, Lục Hoàng Linh1, Lê Thị Hằng1, Huỳnh Thị Quỳnh Trang1, Nguyễn Xuân Huy2, Phùng Thị Bích Hòa1,3* 1 Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế 2 Ban Khoa học Công nghệ và Quan hệ Quốc tế, Đại học Huế 3 Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế *Email: ptbhoa@hueuni.edu.vn Ngày nhận bài: 02/8/2022; ngày hoàn thành phản biện: 29/8/2022; ngày duyệt đăng: 4/4/2023 TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, lá mầm chứa phôi của cây lạc được sử dụng làm mẫu vật chuyển gen từ chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang vector pMVY719/chi42. Sự tích hợp gen chuyển vào bộ gen cây lạc được đánh giá bằng PCR. Kết quả cho thấy các mẫu vật được tiền nuôi cấy 3 ngày, có bổ sung acetosyringone ở nồng độ 200 µM và thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày thích hợp cho sự biến nạp gen vào lá mầm chứa phôi của giống lạc L14. Mật độ vi khuẩn ở OD600 = 1,0 cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất. Cefotaxime 250 mg/L thích hợp cho việc loại bỏ Agrobacterium khỏi mô lá mầm và và kanamycin 100 mg/L thích hợp cho việc sàng lọc mô chuyển gen. Kết quả này là tiền đề để hoàn thiện quy trình chuyển gen chi42 vào giống lạc L14 nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Arachis hypogaea, biến nạp gen, gen chi42, Trichiderma asperellum.1. MỞ ĐẦU Lạc (Arachis hypogaea L.) là loại cây trồng kinh tế, lấy dầu và thức ăn chăn nuôiquan trọng trên thế giới [1, 2]. Việc trồng lạc mặc dù mang lại nguồn thu lớn cho nôngdân nhưng cũng gặp không ít khó khăn do các loại nấm bệnh gây ra. Trong những nămgần đây, bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm Sclerotium rolfsii đã trở thành một mối đedọa lớn đối với sản xuất lạc, đây là một loại bệnh lây truyền qua đất có sức tàn phá mạnhở các vùng trồng lạc trên khắp thế giới. S. rolfsii chủ yếu gây hại phần gốc thân của câylạc làm cho toàn bộ cây bị héo và chết. Trong thời kỳ lây nhiễm, S. rolfsii hình thành một 103Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chi42 vào cây lạc (Arachis hypogaea L.) …số lượng lớn các sợi nấm màu trắng và hạch nấm màu nâu sẫm làm lây lan nhanh chóngtrên đồng ruộng, làm giảm năng suất lạc từ 10% – 80% [3-5]. Hơn nữa, S. rolfsii là mộtvật chủ có phổ gây bệnh rộng có thể lây nhiễm cho hơn 500 loại cây trồng khác nhau [6-9]. Hiện nay, nhiều quy trình chuyển gen đã được áp dụng đối với cây lạc để tạo ragiống lạc có khả năng kháng nấm [10-12]. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen thay đổi phụthuộc vào giống cây nhận gen, gen chỉ thị chọn lọc và chủng Agrobacterium [13], nên việcnghiên cứu tối ưu hóa để xác định các thông số thích hợp để chuyển gen trên một giốnglạc cụ thể trước khi tiến hành là thực sự cần thiết. Quá trình biến nạp gen qua trung gianAgrobacterium tumifaciens muốn có hiệu quả cao đòi hỏi phải tối ưu hóa một số yếu tốảnh hưởng đến quá trình biến nạp của T-DNA. Mục đích của nghiên cứu này nhằm tối ưu hóa một số yếu tố chính như thời giantiền nuôi cấy, thời gian đồng nuôi cấy, thời gian lây nhiễm, mật độ vi khuẩn, nồng độacetosyringone, nồng độ cefotaxime và nồng độ kanamycin ảnh hưởng đến hiệu quảchuyển gen chi42 mã hóa chitinase 42 kDa từ Trichoderma asperellum qua trung gian vikhuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang pMYV719/Chi42 có sử dụng gen đánh dấu nptIItrên giống lạc L14, làm tiền đề để hoàn thiện quy trình chuyển gen tạo ra giống lạc cókhả năng kháng nấm S. rolfsii trong các nghiên cứu tiếp theo.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. Vật liệu Giống lạc (Arachis hypogaea L.) L14 do Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm,Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 chứa vector biểu hiện thựcvật pMYV719 mang gen Chi42 mã hóa chitinase 42 kDa [14] (Hình 1). Gen Chi42 (NCBI:HM191683.1) mã hóa chitinase 42 kDa là gen hoang dại từ T. asperellum SH16 [15] cóchèn trình tự peptide tín hiệu, tổng chiều dài khoảng 1,3 kb được tổng hợp và tạo dòngtrong vector pUC19 [16] bởi Công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam). Hình 1. Cấu trúc của vector pMYV719/chi42. LB và RB: biên trái và phải của vùng T-DNA, NosP ...