Kỹ thuật chuyển gen tế bào động vật

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmix tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Kỹ thuật chuyển gen tế bào động vậtI. KHÁI QUÁT CHUNG:1. KHÁI NIỆM:- Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều gen l ạ đã đ ược thi ết k ế ở d ạng DNA tái t ổ h ợp vào t ế bào ch ủcủa động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmix tái tổ hợp hoặc g ắn vào b ộ gen t ế bào ch ủ. Trong t ế bàochủ,các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn t ới việc xuất hi ện các đ ặc tính m ới c ủa c ơ th ểchuyển gen.- Đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen được xem là thành công khi gen chuy ển vào đ ược t ổ h ợp vàogenome của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp được duy trì ổn định qua các th ế h ệ con cháu.2. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN3. MỤC ĐÍCH CHUYỂN GENE:- Chuyển gen vào các dòng tế bào động vật nuôi để sản xuất protein tái t ổ h ợp.- Tạo vật nuôi chuyển gen với đặc tính cải tiến mới về các s ản phẩm s ữa, thịt, lông…- Biến vật nuôi thành bioreacter sản xuất protein tái t ổ hợp.- Tạo vật nuôi chuyển gen “knock out” làm mô hình nguyên cứu về y sinh học các b ệnh di truy ền.- Chuyển gen liệu pháp nhằm chữa trị các bệnh di truyền (của người).4. ĐỐI TƯỢNG CHUYỂN GENE:- Hầu hết các phương pháp chuyển gen đều được phát triển trên mô hình chuột và sau đó chúng đ ược ứng d ụng trêngia súc, gia cầm.- Việc chuyển gen thường được thao tác trên:+ Tế bào trứng đã thụ tinh.+ Tế bào tinh trùng.+ Mô phôi ở giai đoạn sớm.+ Tế bào gốc phôi.II. CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT CHUYỂN GENE:Gồm các bước cơ bản sau: - Tách chiết, phân lập gene mong muốn. - Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật. - Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gene. - Biến nạp gene tạo phôi đông vật. - Nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử ( đối với ĐV bậc cao). - Phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gene lạ và t ạo ra dòng đ ộng v ật chuy ển gene gốc một cách liên tục. - Sản xuất động vật chuyển gene.Bước 1: Tách chiết, phân lập gene mong muốn: - Gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào vật ch ủ đ ể t ạo ra đ ộng v ật chuy ển gen phải được phân lập và tinh chế(tạo dòng). - Công cụ sử dụng để tạo dòng:+ Enzyme cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase).+ Các mẫu dò (probe).+ Vector.+ Tế bào vật chủ( thường là E.coli).QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, PHÂN LẬP : - Cắt DNA mẫu và plasmid được cắt bởi cùng một enzyme hạn chế. - Chèn gene mong muốn vào plasmid. Tạo plasmid tái t ổ hợp. - Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vật chủ. - Tạo điều kiện thuận lợi cho vật chủ sinh trưởng phát triển.Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn t ừ s ản phẩm bi ểu hi ện của nó nh ư mRNA hoặc protein.+ Từ mRNA dưới tác động của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung m ạch đ ơn (single strandcomplement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA. DNA b ổsung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không chứa các intron mà ch ỉ bao g ồm các exon (Hình 4.2).+ Từ sản phẩm protein,có thể suy ra trình t ự nucleotid của gen cấu trúc trên c ơ s ở trình t ự các axit amin trong phântử protein.Sau đó có thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn.Hình 4.2: So sánh hai dạng gen chuyểnDạng genome bao gồm tất cả các đoạn exon và intron xuất hi ện một cách t ự nhiên. Các đo ạn intron liên quan đ ếnviệc cắt ghép mRNA và biểu hiện của gen. Dạng cDNA là một trình t ự ch ỉ bao g ồm các đoạn exon mã hoá proteincủa gen.Bước 2 : Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật: - Các vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc t ừ các loài khác nhau có thể đ ược k ết h ợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cách sử dụng enzyme hạn ch ế và ligase. - Bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết các enzyme hạn ch ế khác nhau - Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai trò đi ều hoà s ự bi ểu hi ện c ủa gen. Các yếu tố điều hoà cũng có thể nằm ở trong đoạn intron. Yếu tố đi ều hoà ở g ần đ ầu 5’ c ủa gen là promoter, có vai trò quyết định trong việc điều hoà s ự biểu hi ện của gen. - Phương pháp chuyển gene trực tiếp:. Chuyển gene nhờ calcium phosphate. Chuyển gene nhờ xung điện. Chuyển gene nhờ vi tiêm. Chuyển gene nhờ liposome,… - Phương pháp chuyển gene gián tiếp:Chuyển gene nhờ virus:+ vector retrovirus ( RNA )+ vector adenovirus ( DNA sợi kép )+ vector adeno-associated virus ( DNA sợi đơn )+ vector herpes simplex virus ( DNA sợi kép )+ vector baculovirus ( DNA vòng kép ),….a. Phương pháp vi tiêm:Nguyên tắc: - Tiêm trực tiếp DNA ngoại lai vào nhân tế bào động vật nhờ dụng cụ vi tiêm với kim tiêm r ất m ảnh. - Phương pháp này cho kết quả rất cao nhưng số lượng tế bào được xử lý nh ỏ do ph ải thao tác trên từng tế bào. - Thường được dùng để đưa DNA vào hợp tử hoặc các tế bào phôi sớm. - Chuyển gene vào tinh trung hoặc trứng khi đã thụ tinh nhưng ch ưa kết h ợp thành h ợp t ử l ưỡng b ội. - Việc chuyển gene chỉ thành công khi gene chuyển vào di truyền cho các thế h ệ sau.Qui trình: - Thiết kế cấu trúc gene chuyển, lựa chọn gene thích hợp và tạo dòng. - Thu nhận trứng đã thu tinh - Chuẩn bị dung dịch DNA cho vi tiêm, nồng độ từ 1-5 µm/ml - Chuẩn bị tế bào hợp tử - Vi tiêm DNA vào tiền nhân - Chuyển phôi vi tiêm vào cơ thể nhận - Kiểm tra gene chuyển ở con non. Lai tạo để củng cố di truyền.b. Chuyển gene nhờ xung điện:Nguyên tắc: - Khi trong điện trường có một mật độ tế bào cao và tạo ra một xung đi ện ( điện cao th ế trong m ột thời gian rấ ...