Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

Phương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất các sản phẩm sinh-dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lên men. Từ lâu, hệ lên men đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men. Đầu tiên, sự lên men là thuật ngữ dùng cho sản xuất cồn. Sau đó, các nhà vi sinh vật học ứng dụng các nguyên tắc trên để tách chiết các vitamin, các acid hữu cơ và các kháng sinh… ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vậtKỹ thuật nuôi cấy tế bào động vậtPhương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất các sảnphẩm sinh-dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lên men.Từ lâu, hệ lên men đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men.Đầu tiên, sự lên men là thuật ngữ dùng cho sản xuất cồn. Sau đó, các nhà visinh vật học ứng dụng các nguyên tắc trên để tách chiết các vitamin, các acidhữu cơ và các kháng sinh… Kết quả dẫn đến sự phát triển nhanh chóng cácphương pháp và các hệ thống lên men khác nhau.Các nguyên lý tương tự sau đó được ứng dụng cho nuôi cấy sinh khối tế bàođộng vật và thực vật. Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vật khókhăn hơn nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổi chất trongcác loại tế bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinh trưởngchậm của tế bào. Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp hơn sovới vi khuẩn và nấm men, chúng không có thành tế bào như vi khuẩn vì thếrất dễ biến dạng và vỡ. Do đó, các hệ thống khuấy và sục khí được thiết kếkhác với nuôi cấy vi khuẩn. Mặc dù có một số điểm không thuận lợi, nhưnghệ thống lên men đã được sử dụng để nuôi cấy tế bào động vật ít nhất cũngvài chục năm trước đây. Các dòng tế bào khác nhau như BHK-21, LS, các tếbào Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên men theo phương thức nuôicấy chìm ngập trong môi trường để sản xuất các viral vaccine và các sảnphẩm khác.Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắc phục bằngcách đưa vào các cánh khuấy có dạng hình mái chèo. Việc cung cấp khí trựctiếp có thể tạo ra bọt khí dễ làm vỡ tế bào, vì thế cần cung cấp khí bằng cáchkhuếch tán thông qua ống silicone. Môi trường chứa nhiều protein huyếtthanh có khả năng gây ra hiện tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ. Đốivới nuôi cấy mật độ cao, cần cung cấp thêm oxygen.Phương pháp dùng ống silicone để sục khí có nhiều ưu điểm do không tạo rabọt khí và tốc độ truyền oxygen là thỏa đáng.Như vậy, các hệ lên men vi sinh vật được cải tiến thích hợp có thể dùng đểnuôi cấy sinh khối các tế bào động vật sinh trưởng trong dịch huyền phù. Nếumuốn nuôi cấy một dòng tế bào dính bám thì nên dùng một hệ thống chấtmang như là microcarrier.Các dòng tế bào động vật có vú thường được sử dụng trong nuôi cấy làCHO4, NS05, BHK6, HEK-2937 và tế bào võng mạc của người.1. Hệ thống sản xuấtPhát triển một quá trình sản xuất công nghiệp cho protein tái tổ hợp của tếbào động vật có vú thường dựa theo hệ thống được trình bày ở hình 1. Đầutiên, gen quan tâm được tái tổ hợp với các nhân tố điều hòa phiên mã(promoter) cần thiết trong plasmid vector để chuyển vào tế bào. Đồng thời,gen thứ hai (gen chọn lọc-selector, hay còn gọi là gen chỉ thị chọn lọc-selectable marker) cũng được chuyển cho tế bào nhận để phân biệt tế bàođược biến nạp và không biến nạp. Sự hiện diện của tác nhân chọn lọc trênmôi trường nuôi cấy sau khi chuyển gen một vài ngày đã cho phép phân lậpcác tế bào tái tổ hợp sống sót. Các gen chỉ thị chọn lọc được dùng phổ biếnnhất là dihydrofolate reductase (DHFR), một enzyme tham gia trong quátrình chuyển hóa nucleotide, và glutamine synthetase (GS). Trong cả haitrường hợp, sự chọn lọc xảy ra khi thiếu chất chuyển hóa thích hợp trong môitrường (hypoxantine và thymidine, trong trường hợp của DHFR hoặcglutamine trong trường hợp GS), do đó đã ngăn cản sự sinh trưởng của các tếbào không biến nạp.Sinh sản và phát triển dòng tế bào cho các quá trình nuôi cấy để sản xuấtprotein tái tổ hợp mong muốn (protein o.i.). Các đường gợn sóng chỉ ra sốlần cấy chuyển của các dòng tế bào riêng biệt để sàng lọc tế bào đưa vào sảnxuất. Các lọ nhỏ là ngân hàng tế bào được đông lạnh trong nitrogen lỏng.Các bình nuôi xoay (spinner flask) mô tả các hệ thống nuôi cấy quy mô nhỏđể tối ưu hóa quy trình, và các hệ lên men mô tả các quá trình sản xuất ở quymô lớn.Sau khi chọn lọc, các tế bào sống sót (xem như là các tế bào đơn) đượcchuyển vào bình nuôi cấy thứ hai, và quá trình nuôi cấy được phát triển đểsản xuất các quần thể vô tính (clonal populations). Cuối cùng, các dòng riêngbiệt được đánh giá khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp để chọn ra dòng cókhả năng sản xuất cao nhất. Từ những dòng này, một dòng tế bào có tốc độsinh trưởng thích hợp và các sản lượng cao được sử dụng để sản xuất proteintái tổ hợp. Quá trình nuôi cấy sau đó sẽ được thiết lập và tối ưu hóa cho sảnxuất.2. Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng và tế bào vật chủHiện nay, môi trường thương mại dùng cho nuôi cấy tế bào có chất lượng caođã được một số nhà cung cấp hàng đầu sản xuất. Tuy nhiên, việc sản xuấtprotein tái tổ hợp cũng cần phải được tối ưu hóa bằng cách khảo sát trênnhiều công thức môi trường dinh dưỡng. Thông thường, một quá trình sảnxuất riêng biệt đòi hỏi một vài công thức môi trường khác nhau, trong đó mỗicông thức được thiết kế cho một phase đặc trưng của sự ...