Kỹ thuật PRC

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp - phản ứng khuếch đại gen).PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống nhưE. colihaynấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học. Phương pháp PCR được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và đoạt giải Nobel Hóa học tháng 10/1993 ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Kỹ thuật PRC GVHD :Ths. Trần Hồng Bảo QuyênLớp : ĐHSH07LT 1 Danh sách nhómSTT Họ và tên1 Nguyễn Thị Hồng2 Đồng Minh Tùng3 Đỗ Mạnh Vững4 Nguyễn Văn Ngọ5 Phạm Duy Trung6 Phan Thị Hồng Phi 2NỘI DUNGI. Giới thiệuII. Nguyên tắc PCRIII. Quy trình phản ứng PCR 1. Giai đoạn biến tính 2. Giai đoạn bắt mồi 3. Giai đoạn kéo dàiIV. Ý nghĩa và các ứng dụng PCR 3 I. GIỚI THIỆU PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp - phản ứng khuếch đại gen). PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học. Phương pháp PCR được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và đoạt giải Nobel Hóa học tháng 10/1993 Kary Mullis 4II. NGUYÊN TẮCPCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi gắn vào 2 sợi đơn của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. 5II. NGUYÊN TẮCMột phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: 1 chu kỳ GĐ GĐ GĐ Biến tính Bắt mồi Kéo dài 6II. NGUYÊN TẮCCác thành phần tham gia vào thử nghiệm PCR Ðể thử nghiệm PCR có thể chạy được, cần phải có đầy đủ các thành phần sau :1. Nước2. Dung dịch đệm cho phản ứng PCR3. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs)4. Mồi (primer)5. Enzyme DNA polymerase (Taq polymerase)6. DNA mẫu (DNA template) 7III. QUY TRÌNH PHẢN ỨNG PCRTrong phản ứng PCR nhiệt độ là vô cùng quan trọng và kèm theo là yếu tố thời gian.Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong một chu kỳ: 81. Giai đoạn biến tính: Sợi DNA mạch khuôn bị biến tính tách thành 2 sợi đơn ở nhiệt độ 940C trong vòng 30 giây đến 1 phút .Sự biến tính DNA diễn ra với sự có mặt của hai đoạn mồi và các dNTP. 92.Giai đoạn bắt cặp:Nhiệt độ được hạ thấp xuống từ 50 – 650C tốt nhất là 55oC trong khoảng thời gian 1 – 2 phút .Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA polymerase và chiều dài sản phẩm. 103. Giai đoạn kéo dài:Nhiệt độ lúc này được nâng lên 720C trong vòng 30 giây đến 1 phút .Nhờ tác dụng của men Taq polymerase các Nu có sẵn trong ống nghiệm gắn vào các mồi theo nguyên tắc bổ sung=> Một bản sao DNA mới đã được hình thành . 1112Hình: Nhiệt độ của các chu kỳ phản ứngPCR 13IV. Ý NGHĨA VÀ CÁC ỨNG DỤNGPhương pháp này có ý nghĩa lớn vì nhiều lý do:  Độ tinh sach của mẫu không cần cao  Dễ thực hiện  Rẻ tiền và thời gian thực hiện ngắn  Độ chính xác cao đáng tin cậy 14IV. Ý NGHĨA VÀ CÁC ỨNG DỤNGCác ứng dụng chủ yếu của PCR gồm:  Vân tay di truyền  Kiểm tra huyết thống  Chuẩn đoán bệnh di truyền  Tách dòng gen  Gây đột biến điểm  Phân tích mẫu DNA cổ  Xác định gen của các đột biến  So sánh mức độ biểu hiện của gen 15IV. Ý NGHĨA VÀ CÁC ỨNG DỤNGCÁC HẠN CHẾ CỦA KỸ THUẬT PCRDo phương pháp có độ nhạy cao và khuếch đại nucleic acid nên dễ bị ảnh hưởng dẫn đến lỗi trong thao tác và đòi hỏi sự thận trọng trong quá trình thực hiện. Ba vấn đề lớn khi dùng PCR: Kích thước và trình tự cần giới hạn Sự ngoại nhiễm Các sai sót gây ra do Taq polymerase 16 ...