Kỹ Thuật Tách Chiết Nucleic Acid

Các bước cơ bản và phương pháp tách chiết nucleic acid. Các bước tách chiết DNA, RNA, mRNASo sánh tách chiết DNA/ RNA/ mRNASo sánh tách chiết DNA từ thực vật, động vật và vi khuẩn.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Kỹ Thuật Tách Chiết Nucleic AcidMôn: SINH HỌC PHÂN TỬ Đề tài: Kỹ Thuật Tách Chiết Nucleic Acid LỚP : ĐHSH07LT NHÓM : 10 GVHD : Trần Hồng Bảo QuyênThành Viên Nhóm 2 1. Nguyễn Mậu Hòa Ân 2. Nguyễn Văn Dũng 3. Lương Văn Hải 4. Phạm Thị Bích Liên 5. Trần Thị Kim Ngân 6. Trần Quang Sơn 7. Phan Phúc Thiện 8. Trần Thiện TuấnCác bước cơ bản và phương pháp tách chiết nucleic acid. Các bước tách chiết DNA, RNA, mRNASo sánh tách chiết DNA/ RNA/ mRNASo sánh tách chiết DNA từ thực vật, động vật và vi khuẩn. 3Các bước cơ bản – phương pháp táchchiết ACID NUCLEIC. 4Các bước tách chiết DNA.Phương pháp tách chiết DNA cơ bản gồm 3 bướcBƯỚC 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân:− Nghiền tế bào và mô trong hỗn hợp tẩy : SDS, protease thủy phân protein, enzym lysozym, EDTA, . Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, phóng thích DNA ra môi trường đồng thời protein liên kết với DNA cũng tự bị phân hủy. 5Phá vỡ màng tế bào và màng nhân 6Phá vỡ màng tế bào và màng nhân 7 Các bước tách chiết DNA.BƯỚC 2: Loại bỏ thành phần không không phải DNA, chủ yếu là protein. Gây tủa protein bằng dd chloroform: phenol và enzym protein K. Sau khi ly tâm ống nghiệm gồm 3 lớp dd: lớp phenol nằm dưới đáy ống nghiệm, giữa là protein, trên cùng là dịch lỏng chứa DNA. 8Các tách chiết DNA.BƯỚC 3: Làm kết tủa acid nucleic 2 cách thông dụng:− Dùng ethanol nồng độ cao (ethanol: mẫu là 2,5: 1) và ở nhiệt độ thấp, trong môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao).− Dùng isopropanol (isopropanol:mẫu là 1:1), không cần sự hiện diện của muối các DNA trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa, loại bỏ khỏi dịch 9Các bước tách chiết DNA. Tủa thu nhận bằng 2 cách trên được thu nhận bằng ly tâm. Sau đó, rửa kết tủa vài lần trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các vết isopropanol còn dính trong mẫu, sau đó xử lý bằng RNase để loại bỏ RNA. Thu được DNA Làm khô và hòa tan trong dd TE hoặc nước khử ion để tiếp tục nghiên cứu 10Sơ đồ tách chiết DNA tổng số 11Hình ảnh minh họa sợi DNA trong ốngnghiệm 12Các bước tách chiết RNA toàn phần vàmRNA.Các RNA đều là phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi các RNase, RNase có ở khắp nơi.Chính vì vậy, phải có nhiều biện pháp để tránh các tạp nhiễm bởi các RNase từ môi trường: thao tác trong điều kiện vô trùng; mọi dụng cụ, hóa chất đều được khử trùng bằng nhiệt hay được xử lý với DEPC hầu tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần. 13Các bước tách chiết RNA toàn phần vàmRNA.Ly trích RNA toàn phần cũng gồm 3 bước như trích ly DNA:Bước 1: Nghiền tế bào mô trong dung dịch có một một chất tẩy mạnh (SDS) ở nồng độ cao, một tác nhân gây biến tính protein mạnh (guamidium thiocyanate), một chất khử (2- mercaptoethanol). Các chất có tác dụng ức chế hoạt động các RNase nội bào và tách các protein liên kết khỏi 14Các bước tách chiết RNA toàn phần vàmRNA. Bước 2: Loại protein bằng xử lý phenol: chloroform và ly tâm, RNA sẽ hòa tan trong pha nước. Bước 3: Tủa RNA: làm tủa RNA bằng ethanol hoặc isopropanol rồi ly tâm. Dưới dạng kết tủa trong ethanol hoặc đông lạnh ở -700C trong nước có chứa chất ức chế Rnase là R-nasine và cuối cùng là bước tách RNA khỏi DNA bằng enzym 15Các bước tách chiết mRNA. RNA tế bào gồm: rRNA (80-85%), tRNA(15-20%), snRNA (Các bước tách chiết mRNA.Tuy nhiên, mRNA đối với eukaryote có điểm chung là cấu trúc đuôi polyA. Dựa vào cấu trúc này và đặc tính bổ sung A – T của nucleic acid, ta có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng sắc ký ái lực trên cột oligodT-cellulose 17Thu hồi mRNA bằng sắc ký áilực 18Các bước tách chiết mRNA.Hiện nay trên thị trường có những bộ kit sử dụng các viên bi từ có mang oligodT trên bề mặt. Sau khi các mRNA bám lên bề mặt các viên bi từ thông qua liên kết bổ sung với oligodT, các viên bi này được thu nhận lại qua ly tâm và mRNA sẽ được tách ra khỏi các viên bi này và giữ lại. Kĩ thuật này cho phép thu nhận mRNA cả từ những mẫu có khối lượng 19Các bước tách chiết mRNA. 20