Luận văn: ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR (part 3)

Primer (F và R). Agarose. Loading dye 6X (thuốc nhuộm). Thang chuẩn (ladder) 1000 bp (BioRad). TAE 1X. Nước không chứa nuclease (Nuclease free water). 3.5.2 Phương pháp thực hiện 3.5.2.1 Ly trích RNA Bước 1: Cân khoảng 60 mg mẫu đã qua chẩn đoán ELISA cho kết quả dương tính, cắt nhỏ mẫu (
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn: ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR (part 3) 41 Primer (F và R). Agarose. Loading dye 6X (thuốc nhuộm). Thang chuẩn (ladder) 1000 bp (BioRad). TAE 1X. Nước không chứa nuclease (Nuclease free water).3.5.2 Phương pháp thực hiện 3.5.2.1 Ly trích RNA Bước 1: Cân khoảng 60 mg mẫu đã qua chẩn đoán ELISA cho kết quả dương tính, cắt nhỏ mẫu ( 42 Bước 10: Pha DNase I (đang ở dạng bột mịn) với 250 μl Tris 10mM pH 7,5 . Hòa tan bằng pipet (trộn nhẹ). Bước 11: Trộn 5 μl DNase I với 75 μl dung dịch DNase delution trong tube 1,5 ml. Cho 80 µl dung dịch DNase vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây. Loại bỏ dịch lọc (phần dịch bên dưới). Bước 12: Cho 700 μl dung dịch high stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại bỏ dịch lọc. Bước 13: Cho 700 µl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại bỏ dịch lọc. Bước 14: Ly tâm thêm 12000 vòng trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa. Bước 15: Chuyển RNAbc vào tube 1,5 ml có nắp, cho vào 80 μl dung dịch rửa trôi (elution solution) ở bước 6, để 1 phút cho dung dịch thấm, ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở 4oC để thu RNA tổng số. Bảo quản ở 4oC hay sử dụng ngay cho RT – PCR.3.5.2.2 Khuếch đại bằng RT PCR RT PCR 2 bước: Bước 1: Tổng hợp cDNA Thành phần hóa chất: 4 μl 5X iScript Reaction Mix 1 μl iScript Reverse Transcriptase 13 μl Nuclease free water RNA tổng số 2 μl Tổng thể tích 20 μl Thay đổi lần lượt RNA tổng số chạy thí nghiệm: 2 μl, 4 μl, 6 μl, 8 μl, 10 μl. Chu trình nhiệt: 25oC 5 phút 42oC 40 phút 85oC 5 phút Giữ ở 4oC 43 Bước 2: Khuếch đại bằng PCR Sử dụng cặp primer có trình tự như sau: Forward primer: Tm = 64oC 5’-CCGCTTTCTCTGGAGTTTGTGTCGG-3’ Reverse primer: Tm = 64oC 5’-CCCTCGCTTTATTACGTGCCTGCG-3’ Thành phần hóa chất: Thể tích Nồng độ cuối 5 μl iTaq buffer 10X 1X 2,5 μl MgCl2 2,5 mM 1μl 200 µM dNTP 0,5 μl 0,5 μl iTaq DNA polymerase 1 µl 0,4 μM primer F 1 µl 0,4 μM primer R 34 µl Nuclease free water 5µl cDNA Tổng thể tích 50 μl Chu trình nhiệt: 3 phút ở 94oC 1 chu kỳ 1 phút ở 94oC 35 chu kỳ 1 phút ở 57oC 1 phút 15 giây ở 72oC 7 phút ở 72oC 1 chu kỳ Giữ ở 4oC trong 10 phút.3.5.2.3 Đổ gel điện di Chuẩn bị gel agarose 1% 2%. Agarose đã được nấu chín đến 50oC – 60oC, 650W trong 2 phút, đổ vào khuôn và chèn lược vào để tạo gel. Lấy luợc ra, ngâm gel trong dung dịch TAE 1X. Hút 2 μl loading dye trộn đều với 4 μl mẫu PCR. 44 Bơm cẩn thận 6 μl hỗn hợp mẫu và thuốc nhuộm vào giếng. Chạy điện di: Hiệu điện thế 50 V, cường độ dòng điện 245 mA, trong 60 phút. Lấy gel ra, ngâm trong ethidium bromide (1%) trong 20 phút. Rửa gel. Đọc kết quả dưới tia UV. Chụp hình gel để lưu lại.Đọc kết quả phản ứn ...