Luận văn : THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli part 5

Dựavào nguyên tắc này các nhà sản xuất tạo ra các bộ kít chẩn đoán phát hiện vi sinh vậtgây bệnh để người chăn nuôi có thể tự mình kiểm tra xem vật nuôi có mang mầm bệnhhay không như bộ kit chẩn đoán bệnh đốm trắng cho tôm...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli part 5 Bảng 3.2 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình dài ngày (qui trình viện Pasteur Tp. HCM) Mũi mẫn cảm Mũi nhắc lại 1 Mũi nhắc lại 2 Mũi nhắc lại 3 Mũi nhắc lại 4 Mũi nhắc lại 5 0 1 14 28 42 56 70 84 98 112 126 140 154Ngày L.máu Tiêm L.máu Tiêm L.máu Tiêm L.máu Tiêm L.máu Tiêm L.máu Tiêm L.máuThỏ (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) 6 2 2 2 1,5 1,5 1,5 5 2 2 2 1,5 1,5 1,5 Lấy hết 1 1 1 1 50 50 4 1,5 1,5 1,5 1 1 1 3 1 1 1 0,75 0,75 0,75 L. máu = lấy máu Lấy máu kiểm tra kháng thể vào các ngày: 0, 14, 42, 70, 98, 126, 154. 24 25 3.4.2. Thu nhận kháng huyết thanh Kháng huyết thanh thu vào các ngày 25, 30, 35 ở qui trình 1 (bảng 3.1) và ở cácngày 98, 126, 154 ở qui trình 2 (bảng 3.2) Trước khi lấy máu tráng ống bằng nước muối sinh lí 0,85% Vnước muối sinh lí = 0,1 % thể tích máu Lấy máu ở tĩnh mạch tai Sau khi lấy máu xong dùng que cấy khử trùng vét xung quanh ống Cho NaN3 vào VNaN3 = 0,05% Vmáu Để qua đêm ở 4oC Tách lấy huyết thanh, sau đó li tâm bỏ phần cặn. Kháng huyết thanh được chia làm 2 phần: Phần 1: để nguyên kháng huyết thanh, bổ sung glycerol (Vglycerol = 10% VKHT). Bảo quản ở 4oC. Phần 2: kháng huyết thanh được tủa trong amonium sulfate bão hòa. KHT nguyên được sử dụng trực tiếp trong phản ứng ngưng kết hoặc cho gắn vớiprotein A của Staphylococcus aureus hoặc xử lí hấp phụ với kháng nguyên vi khuẩnE. coli E68 và sau đó dùng cho phản ứng ngưng kết đánh giá hiệu giá kháng thể. Việcxử lí KHT được tiến hành theo sơ đồ 3.2 KHT KHT nguyên KHT kết tủa, thẩm tích (bổ sung glycerol) Gắn protein A Hấp phụ Định tính Định lượng Sơ đồ 3.2 Qui trình chung về xử lí kháng huyết thanh 26 3.4.2.1. Tách kháng thể bằng amonium sulfate bão hoà Máu sau khi để ở 4oC qua đêm, đem li tâm tách kháng huyết thanh Cho vào mỗi chai đựng huyết thanh lượng PBS 1X (VPBS = 3Vhuyết thanh) Tủa huyết thanh thỏ bằng dung dịch amonium sulfate 100%S V (NH4)2SO4 = Vhuyết thanh + VPBS Huyết thanh thỏ / PBS 1X được để trong nước đá bào trên máy khuấy từ Nhỏ từng giọt (NH4)2SO4 100%S. Sau khi cho hết lượng (NH4)2SO4 vào tiếp tục khuấy 45 – 60 phút Để 4oC qua đêm Li tâm tách kết tủa Rửa tủa 3 lần bằng dung dịch (NH4)2SO4 45% Cho vào ống 50 ml, giữ tủa / amonium sulfate 45% ở 4oC Đối với trường hợp lấy 1 ml máu: sau khi lấy máu cho 0,01 ml NaN3 để ở 4oC quađêm. Sau đó đem li tâm tách huyết thanh và cho glycerol vào (Vglycerol = 10 % Vh. thanh). Hình 3.1 Tủa kháng huyết thanh 3.4.2.2. Phục hồi kháng thể Kháng thể tủa trong amonium sulfate 45% được phục hồi bằng phương pháp thẩmtích.  Chuẩn bị bao thẩm tích Bao thẩm tích được cắt ra và rửa qua nước cất, sau đó cho vào cốc nước cất chứa2 mM EDTA. Đun 3 giờ rồi rửa lại bằng nước cất cho sạch EDTA. Cho vào bình chứacồn 30o, bảo quản ở 4oC. 27  Thực hiện thẩm tích Cho kháng thể tủa trong amonium sulfate 45% vào bao thẩm tích  dùng kẹp kẹp2 đầu bao thẩm tích lại  đặt bao thẩm tích vào dung dịch buffer PBS  để 5-6 giờ ở4oC. Thực hiện 3 lần thẩm tích như trên sau đó thu kháng thể để xác định hiệu giá. trước thẩm tích ...