Luận văn : Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire part 5

Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 3 với nồng độ gel 1,5 % 4.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo hai loại mẫu khác nhau Chúng tôi đã tiến hành thực hiện phản ứng PCR với 2 loại mẫu khác nhau, kết quả thu được như Bảng 4.5 sau: Bảng 4.5: So sánh tỉ lệ thành công của phản ứng PCR với hai loại mẫu khác nhau Loại mẫu Máu Da tai Số mẫu thực hiện 10 10 Số mẫu thành công 3 7 Tỉ lệ thành công (%) 30 70 ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire part 5 37 12 34 56 7 8 Các băng phụ chuỗi ngắn Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 3 với nồng độ gel 1,5 %4.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo hai loại mẫu khác nhau Chúng tôi đã tiến hành thực hiện phản ứng PCR với 2 loại mẫu khác nhau, kết quảthu được như Bảng 4.5 sau:Bảng 4.5: So sánh tỉ lệ thành công của phản ứng PCR với hai loại mẫu khác nhau Loại mẫu Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ thành công (%)Máu 10 3 30Da tai 10 7 70 Mẫu máu có tỉ lệ thành công thấp hơn mẫu da tai. Các loại protein của máu chủ yếulà các phân tử hemoglobin có chứa nhóm heme (Nguyễn Phước Nhuận, 2003). TheoErlich nhóm này ức chế mạnh đến hoạt động của Taq polymerase ( trích dẫn bởi LêThị Thu Phương, 2003). Do Taq polymerase bị ức chế nên phản ứng PCR có hiệu quảthấp trong việc xác định gen PRLR. 38 LD 1 2 3 4 5 1000 bp 390 bp 400 bp Hình 4.6: Kích thước của sản phẩm PCRGhi chú: 1, 2,3 :sản phẩm PCR được thực hiện bởi cặp primer của A.L Vincent LD (ladder): 100 bp 4.3 Kết quả thực hiện cắt enzyme giới hạn trên các nồng độ khác nhau Việc xử lý enzyme là một trong những công đoạn quan trọng trong việc xác địnhtần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin. Đây là công đoạn rất tốn kém, đòihỏi chi phí cao khi thao tác trên số lượng mẫu lớn. Do đó, việc xác định nồng độ, thểtích của các enzyme tham gia vào quá trình phân cắt sao cho hiệu quả nhất và kinh tếnhất là rất cần thiết. Kết quả của việc cắt enzyme theo các qui trình khác nhau đượctrình bày ở bảng 4.6 dưới đây: Bảng 4.6: So sánh tỉ lệ thành công giữa các nồng độ cắt enzyme khác nhau Nồng độ Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ % thành công 1 10 0 0 2 10 10 100 3 10 10 100 Xử lý enzyme theo qui trình của nhà sản xuất không thành công. Sản phẩm sau khixử lý enzyme không thấy sự phân cắt của enzyme. Đây là qui trình chuẩn yêu cầu 39lượng DNA của mẫu đưa vào tương đối chính xác, lượng enzyme sử dụng tương đốicao. Sản phẩm PCR của chúng ta sau khi thu được thể tích khoảng 25 µl, nồng độ rấtkhó định lượng, không thể đạt đến mức 1000 ng / µl . Như vậy, việc thực hiện theo quitrình này vừa không hiệu quả, vừa tốn kém. Ở qui trình 2, qui trình 3 các sản phẩm sau khi điện di cho kết quả rất tốt, các băngthể hiện rất rõ. Như vậy không có sự khác biệt giữa qui trình 2 và qui trình 3. Nhưng vìlý do kinh tế nên chúng tôi quyết định chọn qui trình 3 sử dụng trong công tác phântích gen thụ thể prolactin. Trong việc xử lý enzyme giới hạn này có nhiều vấn đề cần được quan tâm: Nồng độ gel dùng để điện di: Sản phẩm phân cắt enzyme là các đoạn DNA có kích thước tương đối ngắn từ 50 –121 bp. Nên chúng ta cần sử dụng nồng độ gel cao từ 2.5 – 6 %. Nếu chúng ta sử dụngnồng độ gel thấp thì các băng DNA sau khi phân cắt sẽ bị nhoè, không phân biệt rõràng. Trường hợp cụ thể ở đây là sử dụng nồng độ gel 3.5 %, nhưng theo các nghiêncứu về gen PRLR của Vincent thì ông sử dụng nồng độ gel 6 %.Với nồng độ gel đậmđặc như thế sẽ tạo ra kích thước lổ gel nhỏ giúp cho các đoạn DNA kích thước nhỏphân biệt một cách rõ ràng, nhưng khá tốn kém. 1 2 3 4 LD 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 LD Các băng DNA bị nhoè Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme giới hạn AluI với nồng độ gel 2 % LD: ladder 25 bp Các giếng 1, 2, 3,...,16 không thể phân biệt được các băng DNA Hiệu điện thế và cường độ dòng điện 40 Hiệu điện thế và cường độ dòng điện đóng vai trò rất quan trọng trong quátrình điện di. Hiệu điện thế và cường ...