Luận văn : XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TRÊN BA GIỐNG BÒ part 3

Các gen xác định giới tính trên NST Y sẽ giúp ngày càng hiểu rõ hơn về NST này và sẽ tạo ra được đoạn dò chuyên biệt hoàn toàn để cải thiện độ chính xác của kỹ thuật này. Qua việc tìm hiểu một số phương pháp xác định giới tính, ta thấy đa số các phương pháp không mắc khuyết điểm này thì sẽ gặp phải khó khăn khác và ít có phương pháp nào phù hợp với đòi hỏi của thương mại ngày nay. Do vậy, công cuộc tìm kiếm phương pháp xác định giới tính phù...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TRÊN BA GIỐNG BÒ part 3 21các gen xác định giới tính trên NST Y sẽ giúp ngày càng hiểu rõ hơn về NST này và sẽtạo ra được đoạn dò chuyên biệt hoàn toàn để cải thiện độ chính xác của kỹ thuật này. Qua việc tìm hiểu một số phương pháp xác định giới tính, ta thấy đa số cácphương pháp không m ắc khuyết điểm n ày thì sẽ gặp phải khó khăn khác và ít cóphương pháp nào phù hợp với đòi hỏi của thương mại ngày nay. Do vậy, công cuộctìm kiếm phương pháp xác định giới tính phù hợp vẫn còn tiếp tục. 2 .3.5 Phân biệt giới tính bằng kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) Vào năm 1985, Karl Mullis và ctv đ ã phát minh ra phương pháp tổng hợp DNAtrong ống nghiệm. Phát minh này nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi và đ ã ảnhhưởng mạnh mẽ đến sự chẩn đoán giới tính ở động vật. 2.3.5.1 Cơ sở phản ứng PCR dùng để phân biệt giới tính Phương pháp PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dâychuyền nhờ polymerase) thực ch ất là một phương pháp tạo dòng trong ống nghiệm.Nghĩa là nh ằm mục đích thu nhận một lượng lớn bản sao của một trình tự xác định. Cơsở của phương pháp PCR chính là đặc tính hoạt động của các DNA polymerase. Cácpolymerase này chỉ có khả năng tổng hợp một m ạch mới từ khuôn kể từ một đoạn mồi(là một trình tự DNA ngắn) đã bắt cặp sẵn với khuôn. Trong thực nghiệm, đoạn mồi lànhững trình tự bổ sung chuyên biệt cho đoạn DNA cần tổng hợp. Ph ương pháp PCRgồm 3 bư ớc: (1) biến tính phân tử DNA; (2) bắt cặp đoạn mồi với mạch khuôn; (3)tổng hợp mạch mới. Ba bước này h ợp th ành một chu kỳ và chu kỳ n ày được lặp lạinhiều lần. Chính vì vậy, đo ạn DNA mục tiêu được nhân lên rất nhiều lần và có th ểđược quan sát thông qua những kỹ thuật phân tách và điện di DNA (Hồ Huỳnh Thu ỳDương , 2002). Theo Schorder và ctv (1990), việc sử dụng đoạn mồi chuyên biệt NST Ytrong ph ản ứng PCR giúp khu ếch đại đoạn trình tự DNA chuyên biệt đực. Sự hiện diệnhoặc vắng mặt của sản phẩm PCR cho phép xác định giới tính của phôi. Thông thường, kèm với sự khuếch đại trình tự chuyên biệt NST Y, người tanhân b ản đồng thời một trình tự trên NST sinh dưỡng (Chen và ctv, 2004) hoặc mộttrình tự trên NST X (Alves và ctv, 2003) để làm yếu tố kiểm soát sự hiện diện của vậtliệu và các điều kiện phù hợp cho phản ứng nhân bản. Theo Bondioli và ctv (1989), yêu cầu của một trình tự DNA đặc hiệu cho việcxác đ ịnh giới tính của các phôi cần phải có: 22 - Trình tự DNA phải lặp lại, mục đích là làm tăng tối đa lượng nguyên liệudùng cho ph ản ứng nhân bản. - Trình tự lặp lại phải là trình tự đặc hiệu cho con đực. 2.3.5.2 Một số công trình xác định giới tính bằng PCR Sau hơn một thập niên phát triển, kỹ thuật xác định giới tính bằng PCR đãngày càng chứng tỏ ưu th ế nhanh, nhạy và phù hợp với th ương mại. Những đặc điểmấy được thể hiện qua nhiều công trình được cải tiến của nhiều tác giả khác nhau. Vào 1990, Schorder và ctv công bố công trình xác định giới tính phôi bò giaiđoạn 6 - 7 ngày tuổi dựa trên phản ứng PCR. Đầu tiên, tác giả thiết lập phản ứng bằngcách sử dụng các tế b ào bạch cầu. Sau đó, qui trình đ ược áp dụng trên các m ẫu sinhthiết có từ 1 - 3 tế b ào thu nhận từ phôi. Kết quả xác định giới tính bằng PCR được sosánh với ph ương pháp nhuộm NST và phương pháp lai tại chỗ. Kết quả cho thấyphương pháp PCR cho hiệu quả phân tích cao hơn so với 2 phương pháp còn lại. Vào 1994, Bredbacka và ctv nghiên cứu qui trình xác định giới tính bằng kỹthu ật PCR. Trong công trình này, các tác giả thực hiện sinh thiết phôi ở giai đoạn phôidâu và lấy đi 2 - 8 tế b ào từ phôi để thực hiện việc xác định giới tính. Trong nghiêncứu, các tác giả chỉ sử dụng đoạn mồi đặc hiệu cho giới tính đực m à không sử dụngđoạn mồi cho các trình tự chung của 2 giới để kiểm tra hiệu quả nhân bản của phảnứng. Các tác giả cho rằng việc sử dụng đoạn mồi cho các trình tự chung n ày là khôngcần thiết nếu nh ư đã thực hiện việc kiểm tra sự hiện diện của mẫu sinh thiết trư ớc khithực hiện phản ứng PCR. Tuy nhiên, m ột số phản ứng cho kết quả không rõ ràng. Với mục tiêu chính là phát triển một phương pháp xác định giới tính nhanhcho một vài loài thú h ữu nhũ, Pomp và ctv (1995) đ ã xác định chính xác 209 phôi heocon được thu thập từ 21 con nái tơ sau 10 - 11 ngày giao phối bằng k ỹ thuật P CR.Toàn bộ qui trình từ lúc nhập phôi đến lúc cho kết quả chỉ mất 6 giờ, cải thiện hơn rấtnhiều so với các phương pháp khác. Gen được khuếch đại là sry và cặp gen đ ược dùnglàm đối chứng cho phản ứng là zfy / zfx. Sau đó, ông đã áp dụng phương pháp xác địnhgiới tính này trên các loài hữu nhũ khác như: ngựa, mèo, chó, bò, dê,… và ngườinhưng kết quả không được chính xác và không đáng tin cậy như tr ...