Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 3

Nhưng trong một số trường hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiện tượng này có thể do một trong hai nguyên nhân là DNA phage gắn vào vi khuẩn dưới dạng không hoạt động trong một thời gian hay DNA phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập, hệ thống bảo vệ này là các enzym cắt giới hạn. Đây chính là hiện tượng giới hạn. Khi nghiên cứu DNA phage bằng phương pháp Southern blot, người ta thấy rằng DNA phage...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 3đến hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Nhưng trong một số trườnghợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiện tượng nàycó thể do một trong hai nguyên nhân là DNA phage gắn vào vi khuẩn dưới dạng khônghoạt động trong một thời gian hay DNA phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩntiêu diệt khi vừa mới xâm nhập, hệ thống bảo vệ này là các enzym cắt giới hạn. Đâychính là hiện tượng giới hạn. Khi nghiên cứu DNA phage bằng phương pháp Southern blot, người ta thấy rằngDNA phage trích từ vi khuẩn bị phá vỡ có kých thước nguyên vẹn trong khi DNAphage trích từ vi khuẩn không bị phá vỡ lại bị cắt thành những đọan nhỏ hơn kýchthước đã xác định. Tuy vậy, ngay trên những chủng kháng phage, vẫn có một số vikhuẩn bị phân hủy. Các phage do số ít vi khuẩn này phóng thích có khả năng phân hủychủng vi khuẩn trước kia còn kháng phage. Tất cả những hiện tượng nêu trên là kết quả của một hệ thống gồm hai enzym: Cácenzym cắt giới hạn cắt DNA phage ở những vị trí chuyên biệt, luôn luôn tạo thànhnhững đọan có kých thước nhất định và Methylase là enzym chịu trách nhiệm gắnnhóm methyl vào A hay C ở vị trí cắt của các enzym cắt giới hạn. Khi A hay C đượcmethyl hóa, enzym cắt giới hạn không còn nhận biết được vị trí cắt. DNA vi khuẩnkhông bị chính các enzym cắt giới hạn của chúng cắt là nhờ cơ chế này. Các enzym cắt giới hạn hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote, chưa có hệthống nào tương đương được phát hiện ở eucaryote. Khái niện enzym cắt: Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủygiải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những trình tự xác định. Dựa vào khả năng nàyngười ta chia ra làm 3 loại enzym cắt giới hạn: Loại 1: khi enzym nhận biết được trìnhtự nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide vàgiải phóng độ khoảng vài chục nucleotide. Loại 2: enzym nhận biết trình tự và cắtngay tại vị trí đó. Loại 3: enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA tại vị trí cách đókhoảng 20 nucleotide. Trong các thí nghiệm người ta chỉ sử dụng c ác enzym cắt giớihạn loại 2 Khái niệm trình tự nhận biết: Mỗi enzym cắt giới hạn nhận biết một trình tựnocleotide đặc trưng. Các trình tự này thường bao gồm từ 4 -8 nucleotide (thường là 4hay 6). Các RE khác nhau có cùng trình tự nhận biết gọi là isochizomers. Đối với một 17số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide củatrình tự có thể được thay thế bởi nucleotide khác. Ví dụ : NspI GGGC(A,T)C- vị trí cắt thứ tư có thể là C, A, hay T GCCNNNNNGGC – N là bất kì nucleotide nào. Bgly Đặc trưng quan trọng nhất của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palyndromic,nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng được đọc theo chiều5’ 3’. Như vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch. Enzym cắt giới hạn EcoRI DNA không DNA không được được methyl methyl hoá hoá Enzym cắt Phân cắt giới hạn EcoRI không cắt EcoRI Đầu dính DNA được methyl hoá DNA được methyl hoá Hình 2.4 : Hiện tượng giới hạn ở vi khuẩn (a) DNA của phage bị phân huỷ trong tế bào vi khuẩn (b) DNA của vi khuẩn không đưôc nhận biết bởi enzym cắt Các kiểu cắt của RE loại 2: Cắt tạo đầu bằng (blunt-ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm. Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp lại. Để nối chúng lại phải dùng enzym T4 lygase. HaeIII 5’ GG CC 3’ 3’ GG CC 3’ 5’ GG CC 3’ 3’ CC GG 5’ Cắt đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch. Trong trường hợp này, các ...