Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 5

phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng. Bước 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng. Bước 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200c. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa. Bước 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 5Bước 7: Cho vào mồi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng.Bước 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng.Bước 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200c. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa.Bước 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngược trên giấy thấm.Bước 11: Cho 40µl TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa.Bước 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 0.8% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách. Sau khi điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách trên gel agarose, thực hiện phản ứngcắt DNA plasmid tách chiết và DNA plasnid đối chứng. Thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid và DNA plasmid đối chứng bằng enzymEcoRV, sau đó kiểm chứng bằng cách điện di trên gel agarose sẽ cho biết DNAplasmid chiết tách được có phải là plasmid mà mình mong muốn hay không.3.3.7.2 Phản ứng cắt DNA Plasmid (quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) Định nghĩa đơn vị enzym cắt: Một đơn vị enzym cắt giới hạn là lượng enzym xúctác phản ứng cắt hết một lượng DNA là 1µg trong buffer thích hợp trong thời gian là 1giờ ở nhiệt độ thích hợp. Thực hiện phản ứng cắt với các thành phần như sau 2.5µl Buffer 10X 1µg DNA plasmid 1 unit (0.1 µl) Enzym EcoRV Thêm nước cho tới 25µl Ủ phản ứng ở 37oC trong 1 giờ, biến tính enzym ở 65oC trong 15 phút Điện di 8µl sản phẩm cắt trên gel agrose 0.8%, với hiệu điện thế 100V, trong 30phút để kiểm tra. 333.3.7.3 Quy trình điện di trên gel agarose Chuẩn bị khuôn đổ gel, gắn lược vào khuôn, cân 0.1g agarose cho vào chai chứa12.5 ml dung dịch TAE 0.5X, nấu agarose trong lò vi sóng trong 2 phút, 650W. Để nguội đến 40-500C, đổ gel vào khuôn, khi gel nguội, gỡ lược ra khỏi miếng gel,lấy gel ra khỏi khuôn một cách nhẹ nhàng và đặt vào bồn điện di đã có sẵn dung dịchTAE 0.5X. Chuẩn bị một miếng parafilm (kých thước tuỳ vào số mẫu chạy điện di), hút 2μldung dịch nạp mẫu (loading dye) cho mỗi mẫu cần điện di, hút mẫu cần điện di (thểtích tuỳ thuộc vào nồng độ mẫu) trộn đều với dung dịch nạp mẫu, hút toàn bộ dungdịch vừa trộn nạp vào giếng. Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực, điện di với hiệu điện thế 100V, thời gian 30phút. Sau khi điện di xong, cẩn thận lấy gel ra và nhuộm trong Ethium bromide trong 10phút, rửa kỹ gel và đọc kết quả điện di bằng phần mềm Quantity One (khi nhuộm vớiethium bromide phải tuyệt đối cẩn thận).3.3.8 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR Phương pháp tinh sạch được thực hiện theo kit sử dụng cột GFX do hãngAmersham sản xuất, công ty Nguyên Anh cung cấp. Kit tinh sạch GFX cho phép tinhsạch DNA trực tiếp hoặc thông qua phương pháp cắt gel. Quy trình tinh sạch DNA từ gel Nhằm phân tách và thu nhận duy nhất đoạn DNA mong muốn và DNA plasmid từbản gel agarose sau khi điện diBước 1: Gel sau khi chạy điện di, được đưa lên hệ thống UV.Bước 2: Dùng dao sắc cắt phần gel chứa band DNA cần được tinh sạch cho vào eppendoft 1.5ml ( đã cân trọng lượng trước).Bước 3: Cho capture buffer vào eppendorf chứa gel trên với tỷ lệ 10 mg gel ≈ 10µl capture buffer.Bước 4: Đậy nắp lại ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết (5 – 15 phút).Bước 5: Chuẩn bị cột GFX, đặt vào eppendorf tương ứng với số mẩu cần tinh sạch.Bước 6: Sau khi ủ, đem ly tâm để tập trung mẩu ở đáy eppendorf.Bước 7: Hút hết mẩu sau khi ly tâm cho vào các cột đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. 34Bước 8: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30giây ở 40C.Bước 9: Cho thêm vào cột lượng wash buffer tương ứng (tỉ lệ 1:5 theo thể tích mẫu tinh sạch), ly tâm 10000 vòng/ phút trong 30 giây ở 40C.Bước 10: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới.Bước 11: Hút 50µl elution buffer nhỏ vào cột GFX.Bước 12: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.Bước 13: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C, lấy cột ra, đậy nắp lại.Bước 14: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chưa tinh sạch trên gel agarose 0.8 %, hiệu điện thế 100V trong 30 phút để kiểm tra kết quả tinh sạch. Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFXBước 1: Chuẩn bị cột tinh sạch GFX đặt vào eppendorf tương ứng với số mẫu cần tinh sạch.Bước 2: Hút capture buffer cho vào các cột với tỷ lệ thể tích giữa capture buffer và sản phẩm PCR là 5:1.Bước 3: Cho sản phẩm PCR vào các cột chứa capture buff ...