Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 7

Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD600nm và mật số tế bào vikhuẩn dựa trên sự tương quan của số tế bào theo thời gian nuôi cấy kết hợp với tươngquan của giá trị OD600nm theo thời gian nuôi cấy.Thiết lập quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 7chất, chỉ thu được toàn plasmid. Như vậy, đây là quy trình tách chiết plasmid chuẩn,mọi sai sót xảy ra đều có thể khắc phục. Kết quả tách chiết chủ yếu phụ thuộc nhiềuvào thao tác, hoá chất sử dụng đơn giản. DC 1 2 3 4 5 DNA plasmid 3.0kb Hình 4.10 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 2).(DC) plasmid đối chứng, mẫu 1, 2, 3, 4, 5 là sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạctừ tỉ lệ biến nạp theo thể tích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 : 0.5, điện di ở hiệu điện thế100V, thời gian 30 phút. 1 2 DC 3 4 5 DNA plasmid 3.0kb Hình 4.11 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 3).(DC) plasmid đối chứng, mẫu 1, 2, 3, 4, 5 là sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc từ tỉ lệbiến nạp theo thể tích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 : 0.5, điện di ở 100V trong 30 phút. Qua 3 lần tách chiết, chúng tôi đã hoàn thiện được quy trình tách chiết plasmid từvi khuẩn E.coly biến nạp, kết quả tách chiết không còn lẫn DNA genome và các tạp 49chất khác. Sản phẩm tách chiết có thể dùng để thực hiện phản ứng cắt với enzym cắtgiới hạn, đây là cơ sở để kiểm tra kết quả biến nạp. Những điểm cần lưu ý khi chiết tách plasmid : Khi thêm dung dịch III vào phải ly tâm ngay nếu không DNA của bộ gen sẽ phụchồi cấu trúc vì vậy trong sản phẩm plasmid chiết tách sẽ có lẫn DNA của bộ gen. Ở bước 7 và 8 trong quy trình tách chiết, sau khi ly tâm xong phải lấy ra nhẹ nhàngvà cẩn thận hút phần dịch nổi bên trên không được hút xuống phần bên dưới.4.4 Phản ứng cắt plasmid bằng enzym cắt giới hạn EcoRV EcoRV DC1 DC2 DC3 DNA plasmid 3.0kb Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel agarose 0.8%.(EcoRV) sản phẩm cắt bằng enzym EcoRV của plasmid tách chiết từ tỉ lệ biến nạp theo thểtích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 :0.5 (lần 1), (DC1) plasmid gốc (chưa biến nạp),(DC2, DC3) plasmid đối chứng từ sản phẩm tách chiết. Kết quả trên hình cho thấy plasmid đã được cắt hoàn toàn và đúng như kých củaplasmid đối chứng, vector đã được mở vòng tại vùng MCS. Từ dạng thẳng này chúngta có thể thực hiện phản ứng khử phosphoril ở hai đầu để duy trì sự ổn định củaplasmid nhằm thực hiện phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid.4.5 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid đã cắt bằng enzym EcoRV4.5.1 Tinh sạch đoạn DNA Trong đề tài này, chúng tôi thực hiiện chèn đoạn DNA từ sản phẩm PCR vàoplasmid vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng tạo đầu bằng (blunt end) cho đoạn DNA 50sau đó tinh sạch. kết quả tinh sạch đoạn DNA bằng 2 phương pháp được thể hiện ởHình 4.13 và Hình 4.14 (DC) đoạn DNA đối chứng kích DC TS TS DC thước 629bp từ sản phẩm PCR chưa tinh sạch, (TS) đoạn DNA kích thước 629bp từ sản phẩm PCR đã được tạo đầu bằng và tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX, điện di trên gel agarose 1%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. Hình 4.13 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch trực tiếp đoạn DNA bằng cột GFX. 1 (1) đoạn DNA kích thước 580bp từ sản phẩm PCR đã được tạo đầu bằng và tinh sạch bằng phương pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX Hình 4.14 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phương pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX.. Kết quả điện di (hình 4.13) cho thấy quá trình tinh sạch đã loại được hết các thànhphần tạp trong sản phẩm ...