Luận văn : XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƯỞI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ part 3

Bảng 3.4. Hỗn hợp thực hiện phản ứng PCR. Thành phần PCR buffer dNTPs MgCl2 Primer Taq polymera se DNA H2 O Tổng cộng Bảng 3.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR Các bước phản ứng Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (25 chu kỳ) Tách DNA khuôn Ủ và bắt cặp Kéo dài Giai đoạn kết thúc Nhiệt độ 94oC 94oC 60oC 72oC 72oC Thời gian 5 phút 15giây 30giây 30giây 7phút Nồng độ ban đầu 10X 25mM 25 mM 100pM 5unit/1µl
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƯỞI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ part 3 23chính xác 4 dòng phân lập được là Xanthomonas axonopodis pv.citri . (theo Dong SukPark và ctv, 2005). XACF 5’ CGTCGCAATACGATTGGAAC 3’ XACR 5’CGGAGGCATTGTCGAAGGAA 3’Bảng 3.4. Hỗn hợp thực hiện phản ứng PCR.Thành phần Nồng độ ban đầu Nồng độ sau phản ứng Thể tích (µl) PCR buffer 10X 1X 2,5 dNTPs 25mM 0,2mM 0,2 MgCl2 25 mM 1,5mM 1,5 Primer 100pM 10pM 0,25 5unit/1µl 2unit/1µlTaq polymera se 0,4 DNA 24 Bảng 3.6. Thành phần dung dịch TAE 50X Thành phần Thể tích 1 lít Tris base 2M 242 g Glacial acetic acid 57,1 ml EDTA 0,5 M, pH 8.0 100 ml Quy trình thực hiện1. Chuẩn bị gel agarose để điện di DNA - Chuẩn bị dung dịch TAE 1X, cho dung dịch TAE 1X vào hộp điện di. - Pha dung dịch agarose 0,8 %, gồm agarose và dung dịch TAE 1X. - Đun sôi dung dịch agarose trên lò viba đến khi agarose tan hoàn toàn. Nếu quá trình đun mất nhiều nước thì cần bổ dung thêm dung dịch TAE 1X cho đủ nồng độ yêu cầu. - Để lên máy lắc cho dung dịch tan đều. Đợi đến khi nhiệt độ dung dịch agarose xuống còn 550C thì đổ vào khai điện di có cài sẳn lược. Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp. - Sau khi gel cứng, di chuyển lược ra khỏi gel và đặt khai vào bể điện di chứa TAE 1X sau cho gel ngập trong dung dịch. Chú ý nhẹ tay tránh bọt khí.2. Tiến hành chạy điện di-Lấy một mẫu giấy parafilm, nhỏ những giọt loading buffer lên (mỗi giọt có thể tích khoảng 2 l). Cho thêm 5 l DNA lên mỗi giọt loading buffer và trộn đều. Dùng pipetman hút hỗn hợp DNA cho vào giếng của khai điện di.-Đậy nắp gel và cho chạy điện di, dòng điện cung cấp: 100 vol, 250 mA, định thời gian cho gel chạy (tùy vào sự duy chuyển của băng).-Tắt điện, đem gel nhuộm Ethidium bromide và mang gel đi chụp ảnh với tia UV thông qua phần mềm Quantity on. 25 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1. Phân lập, xác định gram vi khuẩn gây bệnh loét ở cây bưởi da láng và bưởiđường cam Chúng tôi đã tiến hành phân lập được 4 dòng vi khuẩn trên các cây ký chủ khácnhau và bằng dung dịch KOH 3% đã xác định được tât cả là gram âm. Bảng 4.1. Kết quả phân lập và xác đinh gram Dòng vi Địa điểm thu mẫu Cây ký chủ Đặc tính khuẩn Bưởi Da Láng Gram âm XBDL1 Gram âm XBDL2 Tỉnh Đồng Nai Gram âm XBDL3 Bưởi đường Cam XBĐC3 Gram âm 4.2 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh loét trên môi trường PGA và YDC Bảng 4.2. Hình thái vi khuẩn phân lập được từ bưởi Da Láng và Đường Cam Dòng vi khuẩn PGA YDC Vàng, sáp, tròn vun Vàng sữa, sáp, tròn vun XBDL1 Vàng lợt, sáp, tròn vun Vàng sữa, sáp, tròn vun XBDL2 Vàng, sáp, tròn vun Vàng sữa, sáp, tròn vun XBDL3 XBĐC3 Vàng đậm, sáp, tròn vun Vàng chanh, sáp, tròn vun XBDL1 XBDL2 XBDL3 XBĐ C3 26 Hình 4.1. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PGA ở nhiệt độ 28oC sau 48 giờ. XBDL1 XBDL2 XBDL3 XBĐ C3 Hình 4.2. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường YDC ở nhiệt độ 28oC sau 48 giờ. Dựa vào hình thái của khuẩn lạc có thể thấy rõ 4 dòng vi khuẩn có thể chia 2nhóm: nhóm XBDL1, XBDL2, XBDL3 có màu sữa trên môi trường YDC và nhóm cómàu vàng chanh là XBĐC3. Trên mô ...