Nấm sợi (tt) (Filamentous Fungi)

Kỹ thuật phân lập để tìm ra loài nấm mới hay nấm hữu ích là rất quan trọng trong quá trình nghiên cứu. Không có một quy luật chung nào dùng cho phân lập vi sinh vật. Phương pháp phân lập tốt nhất sẽ là phương pháp mà ta lựa chọn để phân lập vi sinh vật mà ta cần. Suy nghĩ một cách sáng tạo cho công việc và thành thạo với các kỹ thuật phân lập mới là yêu cầu chung của bất kỳ một nhà vi sinh vật nào. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nấm sợi (tt) (Filamentous Fungi) Nấm sợi (tt) (Filamentous Fungi)PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP: Kỹ thuật phân lập để tìm ra loàinấm mới hay nấm hữu ích là rấtquan trọng trong quá trình nghiêncứu. Không có một quy luật chungnào dùng cho phân lập vi sinh vật.Phương pháp phân lập tốt nhất sẽ làphương pháp mà ta lựa chọn đểphân lập vi sinh vật mà ta cần. Suynghĩ một cách sáng tạo cho côngviệc và thành thạo với các kỹ thuậtphân lập mới là yêu cầu chung củabất kỳ một nhà vi sinh vật nào. Các nhà nấm học Nhật Bảnthường dùng các phương pháp sauđể phân lập nấm sợi: Sử dụng kimnhọn nhặt bào tử (Dr. ChiharuNakashima); Phân lập bào tử đơnđộc (Dr. Chiharu Nakashima); Sửdụng vi thao tác Skerman (Dr.Katsuhiko Ando); Phương pháppha loãng (Dr. Misa Otoguro);Phân lập từ bào tử đảm (Dr.Chiharu Nakashima); Phương pháprửa bề mặt (Dr. Katsuhiko Ando);Phương pháp sát khuẩn bề mặt (Dr.Ju-Young Park); Phương phápdùng buồng kích ẩm (Dr.Katsuhiko Ando); Phương phápkích thích sự nảy mầm của nấm(Dr.Ju-Young Park); Phương pháp sụckhí (Dr. Katsuhiko Ando). Dướiđây chúng tôi xin phép trình bàymột số phương pháp hay dùng nhất,đã áp dụng phân lập nấm trong đất,trong lá cây rụng và nấm nội sinhendophyte tại Bảo tàng Giốngchuẩn Vi sinh vật- Trung tâm côngnghệ Sinh học- Đại học Quốc giaHà nội trong chương trình hợp tácvề nghiên cứu đa dạng sinh học vớiViện Công nghệ và Đo lường Quốcgia Nhật Bản (NITE- Japan).1. Phương pháp dùng kim nhọn:Sử dụng phương pháp này để phânlập tất cả mọi loại nấm phát triểntrên bất kỳ một cơ chất nào.Cách làm:1) Đặt cơ chất cần phân lập (lá,cành cây mục,...) lên kính hiển vivật kính X10 (độ phóng đại 10 lần)hoặc lên kính lúp.2) Chỉnh tiêu cự để quan sát đượcbào tử, cuống sinh bào tử từ cơchất.3) Khử trùng que nhọn bằng ngọnlửa đèn cồn.4) Đưa que nhọn vào khoảng giữavật kính và cơ chất, nhặt bào tửchuyển sang môi trường phân lập.5) Nuôi cấy bào tử ở nhiệt độ 250C,quan sát sự nảy mầm của bào tửhàng ngày đến khi hình thànhkhuẩn lạc thì chuyển sang môitrường thạch nghiêng.2. Phương pháp phân lập bào tửđơn độc:Sử dụng phương pháp này để phânlập nấm gây bệnh thực vật.Cách làm:1) Chuẩn bị dịch huyền phù bào tử:Dùng kim nhọn đánh bẹt 1 đầu,gắn vào một cái tay cầm chắc chắn,dùng que đó cào vào chỗ trên lá câybệnh có xuất hiện đốm nấm, đặtsang lam kính đã có sẵn một giọtnước vô trùng, khuấy đềù.2) Dùng đầu kim lấy một giọt nướccó hoà tan bào tử đó vẽ một hìnhtam giác lên môi trường thạch nước(Water agar). Ủ 200C trong 24 giờ.3) Quan sát bằng kính hiển vi, tìmbào tử nảy mầm trên môi trườngthạch đĩa theo đường viền tam giáctrên. Đánh dấu điểm có bào tử nẩymầm bằng bút viết kính ở mặt dướiđĩa thạch.4) Chuyển đĩa môi trường thạch cónuôi cấy các bào tử trên sang kínhlúp. Quan sát vị trí đánh dấu bào tửnẩy mầm. Thanh trùng que cấy,dùng que cấy lấy bào tử nảy mầmra, chuyển sang ống nghiệm môitrường thạch nghiêng để nuôi cấy.3. Phương pháp dùng vi thao tácSkerman:Chuẩn bị dụng cụ:Bộ vi thao tác Skerma gồm 5 phần(hình bên).1) Lấy một ống pipet pastơ hơ trênngọn lửa đèn cồn, kéo thành ống rấtnhỏ, dài khoảng 4cm, gắn vào ốngsắt trên cục nam châm D ( cố địnhbằng parafin nóng chảy).2) Cố định phần dụng cụ B vào vậtkính 103) Gắn nam châm có ống thuỷ tinhvào rãnh kim loại của dụng cụ B.4) Di chuyển phần thiết bị có gắncục nam châm lên xuống cho đếnkhi nhìn thấy đầu ống thuỷ tinh ởgiữa vi trường.5) Gắn đầu kim hàn E vào biến thếA và đặt vào vị trí đặt tiêu bản củakính hiển vi. 6) Chỉnh kính, tìm vi trường,quan sát đầu kim hàn, điều chỉnhsao cho đầu que hàn và ống thuỷtinh sát nhau và đều quan sát đượcdưới kính hiển vi. 7) Bật biến thế A nấc cao để đầuque hàn nóng đỏ và tiến về phíaống thuỷ tinh, ấn que hàn chạm vàoống thuỷ tinh để ống thuỷ tinh bắtđầu nóng chảy, kéo nhanh ống thuỷtinh khỏi kim hàn tạo thành quethuỷ tinh thuôn nhọn. 8) Hạ nhiệt độ que hàn bằng cáchgiảm biến thế, dùng đầu que hànchạm nhẹ vào đầu que thuỷ tinhkéo nhẹ tạo thành hình chữ L.Giờ đây ta có thể bắt đầu thực hànhlấy từng bào tử đơn độc trên đĩathạch.Các bước tiến hành:1) Chuẩn bị mẫu: lá cây khô, chovào hộp nhựa hoặc túi ni lông cóchứa nước vô trùng sẵn để làm ẩm,giữ 2-3 ngày ở nhiệt độ phòng, đểkích thích bào tử nẩy mầm.2) Lấy mẫu lá trên cho vào cốcthuỷ tinh, cho thêm nước cất,khuấy nhẹ nhàng cho bào tử nổi lênmặt nước.3) Thu thập bào tử bằng cách lấy 0lam kính để nghiêng 45 so với mặtnước để lấy nước trên bề mặt cốc.Dùng lam kính đó trải một đườngthẳng trên mặt đĩa môi trường phânlập nấm LCA (Low cacbon agar),MEA (Malt extract agar).4) Quan sát đĩa thạch trên dướikính hiển vi, tìm bào tử có hìnhdạng đặc biệt. Khi thấy bào tử cầntìm thì giữ nguyên vị trí.5) Gắn phần dụng cụ hình chữ V(hình C) của bộ vi thao tác vào vậtkính 10 của kính hiển vi. Tiếp đếngắn phần nam châm có que thuỷtinh hình chữ L vừa làm xong vàophần dụng cụ ch ...