Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của kháng nguyên bám dính k88 tái tổ hợp phân lập từ Escherichia coli mang độc tố đường ruột của lợn con cai sữa

Bài viết trình bày kết quả tối ưu biểu hiện của kháng nguyên này ở quy mô phòng thí nghiệm. Kháng nguyên bám dính là các yếu tố gây độc quan trọng của các chủng E. coli gây bệnh đường ruột (ETEC), từ đó mà vi khuẩn có khả năng xâm nhiễm vào ruột non của vật chủ.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của kháng nguyên bám dính k88 tái tổ hợp phân lập từ Escherichia coli mang độc tố đường ruột của lợn con cai sữa TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 120-125 NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA KHÁNG NGUYÊN BÁM DÍNH K88 TÁI TỔ HỢP PHÂN LẬP TỪ Escherichia coli MANG ĐỘC TỐ ĐƯỜNG RUỘT CỦA LỢN CON CAI SỮA Nguyễn Hoàng Lộc1*, Nguyễn Thị Khánh Quỳnh3, Hoàng Tấn Quảng2, Trần Thúy Lan2, Lê Mỹ Tiểu Ngọc2, Đinh Thị Bích Lân2, Phùng Thăng Long4 1 Trường đại học Khoa học, Đại học Huế, *nhloc@hueuni.edu.vn 2 Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế 3 Sở Khoa học và Công nghệ Thừa Thiên - Huế 4 Trường đại học Nông Lâm, Đại học Huế TÓM TẮT: Kháng nguyên bám dính là các yếu tố gây độc quan trọng của các chủng E. coli gây bệnh đường ruột (ETEC), từ đó mà vi khuẩn có khả năng xâm nhiễm vào ruột non của vật chủ. K88 (F4) là kháng nguyên bám dính đầu tiên được phát hiện trong các chủng ETEC phân lập từ lợn và là kháng nguyên bám dính phổ biến nhất ở các chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy trên lợn con sau cai sữa. Chúng tôi đã tạo dòng và biểu hiện thành công gen faeG mã hóa kháng nguyên bám dính K88-1NT trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3). Kết quả tối ưu hóa các điều kiện sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp K88-1NT cho thấy chúng được sản xuất mạnh nhất sau 6 giờ cảm ứng bằng lactose 0,1%, mật độ tế bào (OD600) đạt 0,5 ở 35oC. Môi trường cảm ứng bao gồm Na2HPO4.12H2O 1%, KH2PO4 0,3%, NaCl 0,05%, (NH4)2SO4 1%, MgSO4.7H2O 0,2%, glucose 1,5%, tryptone 1%, và dịch chiết nấm men 1%. Sản phẩm K88-1NT tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni2+ có khối lượng phân tử khoảng 31 kDa. Từ khóa: Escherichia coli, độc tố đường ruột, kháng nguyên bám dính, lợn con cai sữa. MỞ ĐẦU Kháng nguyên bám dính là các yếu tố gây độc quan trọng của các chủng E. coli gây bệnh đường ruột, nhờ các yếu tố bám dính có trên bề mặt như K88, K99, 987P, F17, F18 và F41, vi khuẩn E. coli mới có khả năng bám và xâm nhiễm vào ruột non của vật chủ để gây bệnh [13]. Hầu hết các bộ phận bám dính đều được tìm thấy trên các vi khuẩn đường ruột và được gọi là fimbriae. Fimbriae là những cấu trúc liên kết có tính đa phân tử, khả năng miễn dịch cao và có khả năng liên kết với các thụ thể đặc hiệu [14]. Sau khi phát hiện ra kháng nguyên K88 (F4) lần đầu tiên vào năm 1976, đã có nhiều công trình nghiên cứu đặc điểm và vai trò của yếu tố này trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn gây bệnh [12]. Thiry et al. (1989) [16] đã tạo dòng các trình tự DNA mã hóa kháng nguyên F4 và phân tích sự biểu hiện của pili này trong các plasmid pBR322, pACYC184. Nghiên cứu của Van den Broeck et al. (2000) [17] cho thấy, F4 fimbriae được mã hóa bởi một nhóm 10 gen có chức năng riêng biệt, được ký hiệu tương ứng từ faeA-faeJ; trong đó, faeG là tiểu đơn vị chính. 120 Verdonck (2004) [18] đã phân lập gen mã hóa faeG, tạo dòng trong vector pET30Ek-LIC và biểu hiện với đuôi tận cùng His- và S-tag trong tế bào chất của E. coli BL21(DE3). FaeG tái tổ hợp có hoạt tính sinh học giúp lợn con chống lại sự xâm nhiễm của ETEC. Chúng tôi đã tạo dòng và biểu hiện thành công các kháng nguyên bám dính F4 (K881NT) tái tổ hợp trong tế bào E. coli BL21 (DE3) [8]. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả tối ưu biểu hiện của kháng nguyên này ở quy mô phòng thí nghiệm. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu sử dụng là chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang gen faeG-1NT [8]. Nuôi cấy vi khuẩn Nuôi cấy vi khuẩn E. coli tái tổ hợp trong bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL môi trường dinh dưỡng (pH 7) ở 37oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút và tỷ lệ cấy giống là 0,1%. Cảm ứng biểu hiện kháng nguyên K88-1NT được thăm dò khi quá trình nuôi cấy đạt OD600 = 0,54,0, nhiệt độ cảm ứng từ 20-37oC với IPTG 0,5 Nguyen Hoang Loc et al. Nuôi cấy vi khuẩn 5 Mật độ tế bào (OD600) mM. Thăm dò sử dụng lactose thay thế IPTG làm chất cảm ứng với các nồng độ từ 0,1-2%. Các môi trường được sử dụng để sản xuất kháng nguyên K88-1NT là LB [8], TB [15], YJ [9], cải tiến M9ZB [5] và HSG [11]. Điện di SDS-PAGE Thu hồi sinh khối tế bào E. coli tái tổ hợp sau khi cảm ứng bằng ly tâm, phá vỡ tế bào bằng phương pháp sốc nhiệt và tách chiết protein hòa tan tổng số theo Champion™ pET200 Directional TOPO® Expression Kit (Invitrogen, Hoa Kỳ). Biểu hiện của kháng nguyên bám dính được kiểm tra bằng điện di polyacrylamide gel 12% có SDS ở 60 V. Sau đó, gel được nhuộm với Coomassie Blue R250 và hình ảnh được phân tích bằng phần mềm Quality One (ver 4.1, BioRad). Tinh sạch kháng nguyên K88-1NT Sử dụng kit ProBondTM Purification System (Invitrogen, USA) theo nguyên lý sắc ký ái lực giữa đuôi 6×His trên protein dung hợp và phối tử Ni2+ trên cột sắc ký. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 kDa M NC1 NC2 20oC 4 3 2 1 Thời gian (giờ) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Hình 1. Đường cong sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gen mã hóa kháng nguyên K88-1NT Đường cong sinh trưởng của tế bào được trình bày ở hình 1 với pha lag kéo dài khoảng 2 giờ, pha sinh trưởng kéo dài từ 2-10 giờ, ph ...