Nghiên cứu cấu trúc và sàng lọc dòng nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp đa bản sao biểu hiện nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu mức độ cao

Bài viết đã nghiên cứu tạo dòng thành công các chủng nấm men tái tổ hợp mang gen pdgf và sàng lọc được 2 dòng Pichia pastoris tái tổ hợp mang nhiều bản sao gen pdgf. Các dòng tái tổ hợp đa bản sao gen pdgf sau khi sàng lọc đã được kiểm tra và so sánh khả năng biểu hiện PDGF với dòng đơn bản sao. Kết quả cho thấy khả năng biểu hiện PDGF tăng theo số lượng bản sao gen mục tiêu sát nhập vào trong bộ gen. Chủng đa bản sao thu nhận được có khả năng sản xuất lượng PDGF chiếm trên 50% tổng lượng protein tiết ra môi trường.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu cấu trúc và sàng lọc dòng nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp đa bản sao biểu hiện nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu mức độ cao TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83 NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC VÀ SÀNG LỌC DÒNG NẤM MEN Pichia pastoris TÁI TỔ HỢP ĐA BẢN SAO BIỂU HIỆN NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG TỪ TIỂU CẦU (BB-PDGF-BB) MỨC ĐỘ CAO Vương Cát Khánh, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Phạm Phương Thanh, Đặng Thị Phương Thảo*, Trần Linh Thước Trường Đại học Khoa học tự nhiên tp Hồ Chí Minh, *thaodp@hcmus.edu.vn TÓM TẮT: Nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu PDGF-BB (Platelet derived growth factor) đã được tổ chức FDA-Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) phê chuẩn là sản phẩm sử dụng trong điều trị chứng loét chân do đái tháo đường. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tạo dòng thành công các chủng nấm men tái tổ hợp mang gen pdgf và sàng lọc được 2 dòng Pichia pastoris tái tổ hợp mang nhiều bản sao gen pdgf. Các dòng tái tổ hợp đa bản sao gen pdgf sau khi sàng lọc đã được kiểm tra và so sánh khả năng biểu hiện PDGF với dòng đơn bản sao. Kết quả cho thấy khả năng biểu hiện PDGF tăng theo số lượng bản sao gen mục tiêu sát nhập vào trong bộ gen. Chủng đa bản sao thu nhận được có khả năng sản xuất lượng PDGF chiếm trên 50% tổng lượng protein tiết ra môi trường. Từ khóa: Pichia pastoris, dòng đa bản sao, đái tháo đường, PDGF-BB tái tổ hợp. MỞ ĐẦU PDGF (Platelet derived growth factor) là một yếu tố phân bào chủ yếu của nguyên bào sợi, tế bào cơ trơn và nhiều tế bào khác, được sản xuất từ tiểu cầu. PDGF giữ nhiều chức năng trong cơ thể, đặc biệt là chức năng tham gia điều hòa và thúc đẩy quá trình làm lành vết thương [6]. Protein này tác động đến nhiều tế bào liên quan đến quá trình hàn gắn vết thương như: kích thích sự phân bào và hướng hóa của nguyên bào sợi và tế bào cơ trơn, kích thích đại thực bào sản xuất và tiết những nhân tố tăng trưởng quan trọng, kích thích sự sản sinh những phân tử fibronectin, collagen, proteoglycan và hyaluronic acid. Trong giai đoạn tái tạo, PDGF có vai trò kích thích sản xuất và tiết collagenase bởi nguyên bào sợi cũng như sự co các sợi collagen [1]. Với sự gia tăng bệnh đái tháo đường như hiện nay, tỷ lệ bệnh nhân mắc chứng loét chân ngày càng tăng. Tuy nhiên, tại Việt Nam, nguồn cung cấp PDGF chủ yếu là từ nước ngoài với giá thành cao. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết trong việc nghiên cứu công nghệ sản xuất PDGF nhằm phát triển sản phẩm thuốc điều trị có hiệu quả với giá thành hợp lý. Trong số các hệ thống biểu hiện protein người tái tổ hợp, Pichia pastoris được xem như một hệ thống nổi bật với nhiều ưu điểm như dễ nuôi cấy, tăng trưởng nhanh, protein được biến đổi sau dịch mã. Bên cạnh các ưu điểm trên, hệ thống này có tính bền vững di truyền qua nhiều thế hệ tế bào do vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu có thể được sát nhập vào bộ gen nấm men theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng giữa DNA plasmid và vùng trình tự tương đồng trên bộ gen theo 2 cách: (1) gắn chèn vector vào bộ gen nấm men hoặc (2) thay thế gen, loại bỏ hoàn toàn gen AOX1 trong bộ gen nấm men. Số lượng bản sao của gen mục tiêu sát nhập vào bộ gen chủng chủ nấm men có thể là một trong các yếu tố giúp gia tăng mức độ biểu hiện protein mục tiêu. Hơn nữa, protein ngoại lai được tiết ra ngoài môi trường ở dạng có hoạt tính, vì thế, quá trình thu nhận, tinh chế protein dễ dàng hơn so với protein được biểu hiện ở dạng nội bào. Ngoài ra so với Saccharomyces cerevisiae protein được biểu hiện ở Pichia pastoris không bị đường hóa quá mức và không hình thành liên kết α-1,3 glycan, liên kết này được cho là gây ra đáp ứng miễn dịch khi dùng trong trị liệu [2, 4, 5]. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu plasmid pPICZαA (V195-20, Invitrogen); chủng E. coli DH5α [F-, 80lacZM15, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, -, thi-1, gyrA96, relA1] (Invitrogen) được cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ sinh học phân tử và Môi trường, Trường 77 Vuong Cat Khanh et al. Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh; chủng Pichia pastoris X33 (C180-00, Invitrogen). Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang plasmid biểu hiện PDGF-BB (PDGF) Gen pdgf được thu nhận bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu FXhoI và RnotI. Sản phẩm PCR (357 bp, mã hóa cho chuỗi polypeptide dài 119 acid amin với khối lượng phân tử là 17 KDa) sau khi tinh sạch được xử lý với enzyme XhoI và NotI, sau đó nối vào vector pPICZαA cũng đã được cắt mở vòng bằng 2 enzyme trên. Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp, sử dụng yếu tố chọn lọc là khả năng kháng kháng sinh zeocine. Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf được kiểm tra sự chèn gen pdgf bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi FXhoI và 3’AOX, enzyme cắt giới hạn XhoI và NotI, giải trình tự. Tạo dòng tế bào Pichia pastoris X33 mang gen mã hóa PDGF Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf được thu nhận từ chủng E. coli DH5α bằng phương pháp SDS kiềm, sau đó xử lý bằng enzyme SacI để cắt mở vòng, điện biến nạp vào tế bào Pichia pastoris (P. past ...