Nghiên cứu phân lập và xác lập môi trường nuôi cấy vi nấm cộng sinh phân lập từ rễ cây thông đỏ tại vùng Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng

Mục tiêu của nghiên cứu này là định tên và xác định vi nấm nội cộng sinh có khả năng kết hợp tốt nhất với thông đỏ, xác lập môi trường nuôi cấy thích hợp của vi nấm, đồng thời định lượng taxol tạo thành khi nuôi cấy trong môi trường nghiên cứu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu phân lập và xác lập môi trường nuôi cấy vi nấm cộng sinh phân lập từ rễ cây thông đỏ tại vùng Lạc Dương, tỉnh Lâm ĐồngTẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 84-89NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC LẬP MÔI TRƯỜNGNUÔI CẤY VI NẤM CỘNG SINH PHÂN LẬP TỪ RỄ CÂY THÔNG ĐỎ TẠIVÙNG LẠC DƯƠNG, TỈNH LÂM ĐỒNGĐàm Sao Mai1*, Võ Trung Âu21Trường Đại học Công nghiệp tp. Hồ Chí Minh, *damsaomai@foodtech.edu.vn2Trường Đại học Szent István, HungaryTÓM TẮT: Nghiên cứu này đề cập đến vi nấm nội cộng sinh có khả năng sinh taxol, được phân lập từcác cây thông đỏ (Taxus wallichiana) mọc tự nhiên tại vùng Lạc Dương, Lâm Đồng. Kết quả nghiên cứucho thấy, trên các cây thông đỏ khảo sát chủ yếu tồn tại vi nấm nội cộng sinh Fusarium oxysporum, loàinày đã được xác lập và phát triển tốt trên môi trường MMN cải tiến có bổ sung vitamin B1 (0,05 mg),KH2PO4 (0,9 g), NH4+, (0,15 g), dung dịch FeCl3 1% (1,8 mL); sau 30 ngày nuôi cấy, thu nhận được10,85 g sinh khối/l môi trường (theo khối lượng khô). Nấm F. oxysporum còn được xác định phát triển rấttốt trên môi trường PDB có bổ sung 0,1 g vitamin B1/l môi trường; sau 16 ngày nuôi cấy, thu nhân được9,71 g sinh khối/l môi trường (theo khối lượng khô). Lượng taxol thu nhận được là 250,98 mg/kg khốilượng khô.Từ khóa: Fusarium oxysporum, Taxus wallichiana, nấm cộng sinh.MỞ ĐẦUVi nấm cộng sinh với rễ thực vật nhằm hỗtrợ và cung cấp dinh dưỡng, sự giúp đỡ qua lạiđó giúp cả hai sinh trưởng và phát triển. Câytrồng phải thông qua giai đoạn cộng sinh mớihoàn thành vòng đời hoặc chu kỳ sống củamình. Vì vậy, hiện tượng cộng sinh là giai đoạnphát triển không thể thiếu để chúng tồn tại vàsinh sản [1, 7, 8]. Các nhà khoa học đã xác địnhđược một số hình thức cộng sinh, trong đó, quátrình cộng sinh chủ yếu là giữa nấm và rễ cây,được gọi là nấm rễ cộng sinh. Harley & Smith(1983) [4] cho biết có đến 70-90% trong số cácloài thực vật sống trên đất tham gia vào việchình thành cộng sinh nấm rễ (arbuscularmycorrhizae-AM).Thông đỏ (Taxus wallichiana) thuộc họThanh tùng (Taxaceae), từ vỏ và lá cây thông đỏchiết xuất được taxol và các hoạt chất, dùng đểchữa bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú, ungthư não và có triển vọng xử lý u hắc tố. Hiệnnay, ở Việt Nam, thông đỏ chỉ tồn tại ở một sốvùng rừng của Lâm Đồng với số quần thể và cáthể rất ít và cũng đang đối diện với nguy cơ biếnmất. Đã có một số nghiên cứu thành công liênquan đến cây thông đỏ như: nhân giống hữutính, vô tính; nuôi cấy tế bào thông đỏ [5].Mục tiêu của nghiên cứu này là định tên vàxác định vi nấm nội cộng sinh có khả năng kết84hợp tốt nhất với thông đỏ, xác lập môi tườngnuôi cấy thích hợp của vi nấm, đồng thời địnhlượng taxol tạo thành khi nuôi cấy trong môitrường nghiên cứu.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨURễ cây thông đỏ được lấy từ các cây thôngđỏ tại 5 địa điểm khác nhau ở vùng núi thuộcLạc Dương, tỉnh Lâm Đồng tại độ cao trên1.600 m so với mặt nước biển.Các mẫu thu nhận được rửa sạch bằngethanol 70% (v/v) trong 1 phút và HgCl2 0,1%(v/v) trong 8 phút, sau đó được rửa lại 6 lầnbằng nước cất trước khi đem đi phân lập vi nấmnội cộng sinh.Sử dụng môi trường MMN (0,067 gCaCl2.2H2O; 0,025 g NaCl; 0,5 g KH2PO4; 0,25g (NH4)2)HPO4; 0,15 g MgSO4.7H2O; 0,1 gThiamin.HCl; 1,2 mL FeCl3(1%); 3,0 g Maltextract; 10 g D-glucose; 15 g Agar) và môitrường PDA (0,23 l dịch chiết khoai tây, 20 gdextrose; 0,77 l nước, 15 g Agar) của Difco đểnhân giống và phân lập vi nấm. Chọn lọc vinấm nội cộng sinh phù hợp cho nghiên cứu tiếp.Xác định môi trường tối ưu của vi nấm nộicộng sinh chọn lọc qua môi trường MMN dạnglỏng và môi trường PDB có bổ sung vi lượng(bảng 1).Dam Sao Mai, Vo Trung AuBảng 1. Thành phần môi trường của các công thức khảo sát trên môi trường MMNCôngthứcCT CơbảnNT1NT2NT3NT4NT5NT6NT7NT8NT9NT10NT11NT12NT13NT14NT15NT16NT17NT18NT19NT20NT21NT22NT23NT24NT25NT26Thành phần môi trường (g) (*)Glucose(g)MgSO4.7H2O (g)CaCl2.2H2O (g)NaCl(g)VTB1(mg)Malt(g)NH4+(g)KH2PO4(g)FeCl3 1%(mL)100,150,0670,0250,130,250,51,210101010101010101010101010101010101010101010101010100,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,150,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0670,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,0250,150,050,050,150,050,150,150,050,050,150,150,050,150,050,050,150,10,10,10,10,10,10,10,10,050,15151515151515151515333333330,150,150,350,350,150,150,350,350,150,150,350,350,150,150,350,350,250,250,150,350,250,250,250,250,250,250,10,10,10,10,90,90,90,90,10,10,10,10,90,90 ...