Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử xác định các kiểu gen hệ nhóm ABO cá thể

Những nghiên cứu về các dòng cADN mã hoá kháng nguyên nhóm máu ABO [6] đã xác định đ-ợc trình tự đoạn gen ABO với kích th-ớc 1000bp. Đồng thời qua những nghiên cứu này, ng-ời ta chứng minh đ-ợc rằng gen mã hoá kháng nguyên A và B có một số gốc bazơ khác nhau ở những vị trí xác định. Điều này dẫn đến những thay đổi một số trình tự axit amin làm cho hoạt tính của A và B-transferase khác nhau. Sự khác nhau đó đã đ-ợc các tác giả tìm ra tại nucleotit 700 của...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử xác định các kiểu gen hệ nhóm ABO cá thể TCNCYH 23 (3) 2003Nghiªn cøu sö dông c¸c ph−¬ng ph¸p sinh häc ph©n tö x¸c ®Þnh c¸c kiÓu gen hÖ nhãm ABO c¸ thÓ Nghiªm Xu©n Dòng1, TrÇn Minh §«n1, L−¬ng ThÞ YÕn1 vµ Lª §øc §µo2 1 Côc Kü thuËt Hãa – Sinh, Tæng côc Khoa häc kü thuËt vµ C«ng nghÖ - Bé C«ng an. 2 ViÖn Sèt rÐt Ký sinh trïng vµ C«n trïng trung −¬ng Kü thuËt huyÕt häc x¸c ®Þnh ®−îc 4 nhãm m¸u lµ A, B, O, AB. Sö dông kÜ thuËt PCR vµ c¸c lo¹ienzym c¾t giíi h¹n cã thÓ x¸c ®Þnh kiÓu gen cña hÖ kh¸ng nguyªn nµy, cho phÐp x¸c ®Þnh ®−îc 6tr¹ng th¸i gen lµ AA, BB, OO, AB, AO, BO. Ph−¬ng ph¸p míi sö dông cã ®é nh¹y rÊt cao, cã thÓx¸c ®Þnh ®−îc c¸c mÉu ADN tõ vÕt m¸u, n−íc bät, tãc nªn ®−îc ¸p dông cã hiÖu qu¶ trong c«ngt¸c gi¸m ®Þnh h×nh sù.I. §Æt vÊn ®Ò kü thuËt PCR, nhãm t¸c gi¶ ®· nh©n ®o¹n gen ABO t¹o ra mét s¶n phÈm cã kÝch th−íc Nh÷ng nghiªn cøu vÒ c¸c dßng cADN m· 209/210bp. S¶n phÈm nµy sÏ mang vÞ trÝ ®étho¸ kh¸ng nguyªn nhãm m¸u ABO [6] ®· x¸c biÕn t¹i baz¬ 258 nÕu allen O cã mÆt. §«i måi®Þnh ®−îc tr×nh tù ®o¹n gen ABO víi kÝch tiÕp theo (DHF3 vµ DHR3) sÏ nh©n ®o¹n genth−íc 1000bp. §ång thêi qua nh÷ng nghiªn ABO t¹o ra mét s¶n phÈm cã kÝch th−íc 175bp.cøu nµy, ng−êi ta chøng minh ®−îc r»ng gen S¶n phÈm nµy mang vÞ trÝ ®ét biÕn t¹i baz¬ 700m· ho¸ kh¸ng nguyªn A vµ B cã mét sè gèc nÕu allen B cã mÆt. Sau ®ã, c¸c t¸c gi¶ sö dôngbaz¬ kh¸c nhau ë nh÷ng vÞ trÝ x¸c ®Þnh. §iÒu kü thuËt c¾t s¶n phÈm PCR b»ng hai lo¹inµy dÉn ®Õn nh÷ng thay ®æi mét sè tr×nh tù axit enzym KpnI vµ AluI. §èi víi s¶n phÈmamin lµm cho ho¹t tÝnh cña A vµ B-transferase 210/209pb, nÕu allen O cã mÆt, KpnI sÏ c¾tkh¸c nhau. Sù kh¸c nhau ®ã ®· ®−îc c¸c t¸c gi¶ thµnh c¸c ®o¹n 177bp vµ 32bp. Cßn s¶n phÈmt×m ra t¹i nucleotit 700 cña gen B. T¹i vÞ trÝ 175bp nÕu cã mÆt allen B, AluI sÏ c¾t s¶n phÈmnµy, baz¬ G ®−îc thay thÕ b»ng baz¬ A cã ë thµnh c¸c ®o¹n 94bp vµ 81bp. Cuèi cïng, dùathÓ d¹i. VÞ trÝ ®ét biÕn nµy t¹o ra ®iÓm nhËn vµo sù thÓ hiÖn cña c¸c b¨ng ADN trªn ®iÖn dibiÕt cña enzym giíi h¹n AluI. §ång thêi, ®å (gel agarose), ng−êi ta cã thÓ ph©n tÝch tÝnhnghiªn cøu trªn gen O chøng minh sù v¾ng mÆt ®a h×nh cña ®o¹n gen ABO thÓ hiÖn ë 6 kiÓucña baz¬ G ë vÞ trÝ 258, do ®ã gen m· ho¸ tæng gen kh¸c nhau lµ: AA, BB, OO, AO, BO, AB.hîp protein kh«ng cã ho¹t tÝnh transferase. §étbiÕn nµy t¹o thªm mét vÞ trÝ nhËn biÕt n÷a ®èi Nh÷ng nghiªn cøu trªn ®· t¹o c¬ së ®Ó kh¾cvíi gen O bëi enzym giíi h¹n KpnI. phôc mét lo¹t khã kh¨n gÆp ph¶i khi x¸c ®Þnh nhãm ABO b»ng kü thuËt huyÕt thanh häc, TiÕp theo nh÷ng nghiªn cøu trªn, Carll Ladd ®ång thêi víi c¸c kü thuËt hiÖn ®¹i, cã ®é nh¹yvµ céng sù 1996 [2] ®· ®−a ra mét ph−¬ng ph¸p vµ tÝnh ®Æc hiÖu cao cña sinh häc ph©n tö, viÖcnh»m x¸c ®Þnh kiÓu gen nhãm m¸u ABO. Sö x¸c ®Þnh nhãm m¸u ABO kh«ng chØ dõng l¹i ëdông ®«i måi thø nhÊt (DHF1 vµ DHR2) b»ng møc ®é x¸c ®Þnh kiÓu h×nh víi 4 nhãm nh−74TCNCYH 23 (3) 2003tr−íc kia mµ thay vµo ®ã cã thÓ x¸c ®Þnh ®−îc §· cã rÊt nhiÒu ph−¬ng ph¸p ®−îc nªu ra ®Ó6 kiÓu gen kh¸c nhau, do ®ã t¨ng kh¶ n¨ng t¸ch chiÕt ADN tõ c¸c tµi liÖu ®· ®−îc c«ng bèph©n biÖt hÖ thèng nhãm ABO. trªn thÕ giíi vµ trong n−íc. Trong nghiªn cøu nµy, chóng t«i ®· sö dông ph−¬ng ph¸p t¸ch Víi nh÷ng c¬ së lý thuyÕt vµ nghiªn cøu chiÕt ADN cña Banaschak S. vµ céng sù [1].thùc tÕ ®· nªu, chóng t«i ®Æt vÊn ®Ò nghiªn cøux¸c ®Þnh c¸c kiÓu gen hÖ nhãm ABO c¸ thÓ b. Kü thuËt PCR:b»ng c¸c kü thuËt hiÖn ®¹i cña sinh häc ph©n Qu¸ tr×nh PCR ®−îc tiÕn hµnh trong èngtö. KÕt qu¶ nghiªn cøu cña chóng t«i sÏ gãp nghiÖm eppendorf 0,5 ml. Thµnh phÇn ph¶nphÇn bæ sung mét ph−¬ng ph¸p míi cã ®é nh¹y øng gåm: 0,2mM dNTPs; 10mM tris HCl,rÊt cao phôc vô viÖc gi¸m ®Þnh truy nguyªn 50mM KCl, 1,5 mM MgCl2; 2 ®¬n vÞ Taqnhãm dïng ...