Nghiên cứu tạo chủng escherichia coli tái tổ hợp biểu hiện interleukin-3 và interleukin-11 người dưới dạng lai với PelB

Trong bài viết này, chúng tôi thiết kế tín hiệu tiết PelB ngay trước gen il-3 và il-11 để định hướng biểu hiện protein IL-3 và IL-11 người tái tổ hợp ở khoang chu chất của E. coli, đồng thời tránh sự gắn không mong muốn của methionin vào đầu chuỗi polypeptide mới tổng hợp.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu tạo chủng escherichia coli tái tổ hợp biểu hiện interleukin-3 và interleukin-11 người dưới dạng lai với PelBTẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3se): 94-99NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI TÁI TỔ HỢPBIỂU HIỆN INTERLEUKIN-3 VÀ INTERLEUKIN-11 NGƯỜIDƯỚI DẠNG LAI VỚI PelBNguyễn Thị Quý, Dương Thu Hương, Lê Ngọc Giang,Lê Thị Thu Hồng, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải*Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *tnhai@ibt.ac.vnTÓM TẮT: Interleukin-3 (IL-3) và Interleukin-11 (IL-11) là những cytokine đa chức năng, đóng vai tròđiều hòa sự nhân lên, biệt hóa và trưởng thành của nhiều loại tế bào máu. Gen mã hóa cho protein IL-3 vàIL-11 của người (mã số NM_000588 và NM_000641 trên ngân hàng gen quốc tế) được tổng hợp nhân tạocùng tín hiệu tiết pelB và trình tự nhận biết của hai enzyme hạn chế NdeI ở đầu 5 và NotI ở đầu 3, đượcđưa vào vector tách dòng pUC57. Sau đó toàn bộ đoạn DNA được chuyển vào vị trí NdeI- NotI của vectorbiểu hiện pET22b(+) để tiến hành biểu hiện gen il-3, il-11 trong vi khuẩn E. coli BL21. Kết quả cho thấy ở37oC và nồng độ chất cảm ứng là 0,5 mM IPTG, IL-3 được biểu hiện dưới hai dạng: dạng đơn (IL-3nguyên vẹn đã được cắt bỏ tín hiệu tiết PelB) có kích thước khoảng 15 kDa và dạng lai với tín hiệu tiếtPelB (khoảng 18 kDa). Protein IL-11 biểu hiện ở mức độ thấp và ở dạng đơn, có kích thước khoảng 19kDa đúng với kích thước của protein IL-11 chuẩn.Từ khóa: Escherichia coli, Interleukin-3, Interleukin-11, Isopropylthio-β-galactoside (IPTG), tín hiệu tiết PelB.MỞ ĐẦUInterleukin-11 (IL-11) là một cytokine thuộchọ Interleukin-6, đóng vai trò điều hòa sự nhânlên, biệt hóa và trưởng thành của nhiều loại tếbào máu. Theo Souto et al. (2012) [6], proteinIL-11 người tái tổ hợp sản xuất bằng công nghệDNA tái tổ hợp từ chủng E. coli hiện nay đượcsử dụng trên toàn thế giới để phòng bệnh giảmtiểu cầu sau hóa trị liệu và giảm nhu cầu truyềntiểu cầu đối với bệnh nhân bị u tủy ác tính.Interleukin 3 (IL-3) cũng là một cytokine cóbản chất là glycoprotein, tham gia vào quá trìnhtự đổi mới và sống sót của các tế bào nguồn tạomáu, sự nhân lên, biệt hóa của các tế bào nguồnvà hoạt hóa chức năng của các bạch cầu trưởngthành [3].Trong số các hệ biểu hiện protein ngoại laihiện nay thì vi khuẩn Gram âm E. coli vẫn làmột trong những hệ biểu hiện thu hút nhiềuquan tâm nhất vì chúng có tốc độ sinh trưởngnhanh với mật độ tế bào cao trên môi cơ chấtkhông đắt tiền cũng như các đặc điểm di truyềnđã được nghiên cứu đầy đủ. Hơn nữa, trên thịtrường hiện nay thương mại nhiều loại vectortách dòng và chủng đột biến đối với hệ biểuhiện này.Protein ngoại lai tổng hợp trong tế bào chất94ở E. coli thường đi kèm với sự cuộn xoắn khôngchính xác và tích tụ ở dạng thể vùi. Mặc dù sựtạo thành thể vùi thuận lợi cho tinh sạch nhưngviệc tái cấu trúc để đảm bảo chức năng sinh họcchưa hiệu quả. Việc tiết protein vào khoang chuchất sẽ có nhiều ưu điểm, nhất là giảm sự phâncắt protein đích, tinh sạch dễ dàng, protein độcvới tế bào khu trú trong khoang chu chất. Hầuhết các protein được tiết ra khoang chu chất làprotein dạng tan, có chức năng sinh học.Khoang chu chất của tế bào E. coli chứa cácenzyme xúc tác việc tạo thành hoặc tái sắp xếpcầu disulfide, vì vậy các protein tái tổ hợp biểuhiện trong E. coli thường được định hướng vậnchuyển đến đây [1].Có nhiều chuỗi tín hiệu xuất phát từ nhữngprotein tiết trong tự nhiên như OmpA, OmpT,PelB, β-lactamase và alkaline phosphatase giúpvận chuyển các polypeptide ngoại lai qua màngtrong nếu được thiết kế ở dạng lai với chúng.Người ta thường thiết kế thêm tín hiệu dẫnđường vào đầu N của protein đích. Chúng sẽđịnh hướng chuyển protein ra khoang chu chấtvà sau đó bị cắt bởi peptidase của màng trong,phần protein còn lại có hoạt tính được địnhhướng tới khoang chu chất của tế bào.Theo Georgiou & Segatori (2005) [2], nhờNguyen Thi Quy et al.tiến bộ về công nghệ biểu hiện trong thời gianqua, nhiều protein của động vật có vú được sảnxuất đều đặn dưới dạng tiết, năng suất lên tớigam/lít.Trong bài báo này, chúng tôi thiết kế tín hiệutiết PelB ngay trước gen il-3 và il-11 để địnhhướng biểu hiện protein IL-3 và IL-11 người táitổ hợp ở khoang chu chất của E. coli, đồng thờitránh sự gắn không mong muốn của methioninvào đầu chuỗi polypeptide mới tổng hợp.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUVật liệuGen il-3 và il-11 được tổng hợp bởi hãngGenscript (Hoa Kỳ) và tách dòng trong vectorpUC57. Plasmid pET22b(+) được dùng làmvector biểu hiện. Chủng E. coli DH10b dùngcho mục đích tách dòng gen. Chủng E. coliBL21 (Invitrogen) được dùng làm chủng biểuhiện protein.Enzyme hạn chế NotI, NdeI, DNA marker,protein chuẩn của hãng Fermentas (Đức).Skimmedmilked(Difco),3,3′,5,5′Tetramethylbenzidine (TMB, Sigma). Proteintái tổ hợp IL-3 người chuẩn (Biovision) và IL11 chuẩn (Sigma) được dùng làm đối chứngdương. Kháng thể kháng IL-3 (Bioworld) và IL11 (Abcam) được sử dụng cho phản ứng laiwestern b ...