Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học phân tử để tách dòng gen mã hóa enzyme Luciferase

Trên trình tự gen này không có vị trí cắt của các enzyme giới hạn là HindIII, BamHI, NdeI, XhoI...., do đó chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzyme NdeI vào đầu 5 và HindIII vào đầu 3 của gen mã hóa luciferase để phục vụ cho mục đích biểu hiện và sản xuất enzyme này bằng phương pháp tái tổ hợp.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học phân tử để tách dòng gen mã hóa enzyme LuciferaseHóa học & Kỹ thuật môi trườngNGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYME LUCIFERASE Trần Thị Thanh Quỳnh1, Tô Văn Thiệp1, Nguyễn Văn Hoàng1,Trần Thị Thu Hường1, Lê Duy Khánh1, Nguyễn Đình Hưng1, Phạm Kiên Cường1* Tóm tắt: Đoạn gen mã hóa cho enzyme luciferase từ đom đóm ở Việt Nam đã được nhân dòng thành công vào vector pGEMT bằng phương pháp RT-PCR (Reverse transcription-Polymerase chain reaction) và ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử khác. Sau đó, plasmid mang đoạn gen này (pGEM-luciferase) đã được biến nạp vào tế bào E.coli và giải trình tự. Kết quả cho thấy: đoạn gen có kích thước khoảng 1,6 kb, có trình tự tương đồng 100% so với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (X66919.1). Trên trình tự gen này không có vị trí cắt của các enzyme giới hạn là HindIII, BamHI, NdeI, XhoI...., do đó chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzyme NdeI vào đầu 5 và HindIII vào đầu 3 của gen mã hóa luciferase để phục vụ cho mục đích biểu hiện và sản xuất enzyme này bằng phương pháp tái tổ hợp.Từ khóa: Enzyme luciferase, Đom đóm, Nhân dòng luciferase. 1. MỞ ĐẦU Luciferase là nhóm enzyme có khả năng xúc tác cho phản ứng phát quang sinh học,thuộc họ protein dạng aldelynate, có một nhóm oxy-4-oxidoreductase để thực hiện hoạtđộng khử carboxyl hóa và thủy phân ATP. Hiện nay đã có trên 20 loại luciferase khácnhau đã được xác định dựa vào nguồn gốc và cơ chế tác dụng của chúng. Trong đó,luciferase của đom đóm được tập trung nghiên cứu nhiều nhất [1,2,3]. Một trong những ứng dụng quan trọng của luciferase là để phát hiện tổng số vi sinh vậtvà kiểm tra mức độ an toàn của lương thực, thực phẩm và phát hiện sớm mức độ nhiễmkhuẩn của bề mặt vật thể trong chế biến cũng như bảo quản lương thực, thực phẩm và ydược, với hệ thống enzym-cơ chất cực nhạy của đom đóm. So với phương pháp truyềnthống đòi hỏi tốn nhiều thời gian để xử lý mẫu và nuôi cấy đếm khuẩn lạc, thì phươngpháp phát quang sinh học vượt trội hơn hẳn về mặt thời gian và độ chính xác. Nhiều hãngsản xuất kít trên thế giới đã phát triển thành công kít phát hiện tổng số vi sinh vật bằngphương pháp quang sinh học (Clean-Trace, Kikoman, Bio Thema...)[3,7]. Trên thế giới, đãcó nhiều công trình nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện thành công đoạn gen mã hóa choenzyme luciferase của đom đóm [4,8,9] và hệ thống enzym luciferase đã trở thành mộtcông cụ đa năng với các ứng dụng khác nhau [5,6,7] bao gồm: thử nghiệm gen chỉ thịtrong cả vi khuẩn và các dòng tế bào có nhân điển hình; phát hiện sự có mặt của các visinh vật và các hợp chất độc hại, tương tác của vi khuẩn/virut với tế bào chủ thông quahình ảnh bên trong cơ thể, phân tích biểu hiện gen ở các cơ thể động vật sống và hình ảnhkhối u...Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về enzyme luciferase [1,2,3], tuynhiên các công bố về ứng dụng của phương pháp phát quang sinh học nói chung vàluciferase nói riêng còn hạn chế và chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu về enzyme này.Đặc biệt là việc ứng dụng enzyme luciferase trong các lĩnh vực phục vụ cho quân đội nhưtrong trinh sát phát hiện chất độc hóa học, quan trắc, kiểm soát các chất độc trong lươngthực, thực phẩm và môi trường đối với lực lượng tác chiến trong điều kiện đặc biệt... cònchưa được quan tâm nghiên cứu. Mặt khác enzyme luciferase thông thường được thu nhận từ các sinh vật có khả năngphát sáng trong tự nhiên như đom đóm, sứa... Tuy nhiên, việc tách chiết và thu nhậnenzyme từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên là rất khó khăn do không chủ động nguồn140 T.T.T. Quỳnh, T.V. Thiệp, …, “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ… enzyme luciferase.”Nghiên cứu khoa học công nghệnguyên liệu và đạt hiệu quả thu hồi thấp. Vì vậy, tổng hợp được gen mã hóa cho enzymeluciferase, từ đó hướng tới việc ứng dụng và phát triển sản xuất enzyme luciferase bằngcông nghệ tái tổ hợp là rất cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Chính vì thế, trongnghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành nhân dòng và giải trình tự đoạn gen mã hóa choenzyme luciferase để tạo tiền đề, phục vụ cho việc nghiên cứu sản xuất enyme luciferasetheo con đường tái tổ hợp 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. Nguyên liệu và hóa chất - Đom đóm thu được ở Việt Nam (Nghệ An, 19/2/2015) - Hóa chất: Các hóa chất thường dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử của hãngSigma, Mecrk, Thermo Scientific...2.2. Thiết bị Máy PCR và thiết bị điện di ngang của hãng Bio-rad (Mỹ), hệ thống chụp ảnh điện diMega bio print của hãng Fisher biotech (Úc), máy ly tâm lạnh của hãng Orto alresa (TâyBan Nha).2.3. Phương pháp nghiên cứu2.3.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số RNA tổng số được tách chiết từ đom đóm theo bộ kit của hãng ANABIO. Nghiền 30mg phần đuôi của đom đóm trong nitơ l ...