Nhân dòng và phân tích trình tự gene 28S rRNA của chủng nấm đảm sinh tổng hợp cellulase

Trong nghiên cứu này, chúng tôi mô tả kết quả nhân dòng và phân tích trình tự gene 28S rRNA của chủng nấm đảm NDVN sinh tổng hợp cellulase phân lập ở Việt Nam. Trình tự gene 28S rRNA của chủng NDVN có kích thước 602 bp và có độ tương đồng cao với một đại diện của chi nấm đảm Peniophora (96 - 99,8%). Chủng NDVN được đặt tên là Peniophora sp. NDVN01. Trình tự gene 28S rRNA của chủng này đã được đăng ký trên Genbank với mã số JF 925333.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nhân dòng và phân tích trình tự gene 28S rRNA của chủng nấm đảm sinh tổng hợp cellulaseTrịnh Đình Khá và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ96(08): 115 - 118NHÂN DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE 28S rRNACỦA CHỦNG NẤM ĐẢM SINH TỔNG HỢP CELLULASETrịnh Đình Khá1*, Quyền Đình Thi2, Nghiêm Ngọc Minh212Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái NguyênViện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt NamTÓM TẮTCellulase là enzyme xúc tác thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong phân tử cellulose. Cellulasecó nhiều ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp. Hiện nay, cellulase được sản xuất bằngphương pháp lên men các chủng vi khuẩn, nấm và nấm đảm.Trong nghiên cứu này, chúng tôi mô tả kết quả nhân dòng và phân tích trình tự gene 28S rRNAcủa chủng nấm đảm NDVN sinh tổng hợp cellulase phân lập ở Việt Nam. Trình tự gene 28S rRNAcủa chủng NDVN có kích thước 602 bp và có độ tương đồng cao với một đại diện của chi nấmđảm Peniophora (96 - 99,8%). Chủng NDVN được đặt tên là Peniophora sp. NDVN01. Trình tựgene 28S rRNA của chủng này đã được đăng ký trên Genbank với mã số JF 925333.Từ khóa: cellulase, nhân dòng, gene 28S rRNA, giải trình tự, Peniophora sp. NDVN01MỞ ĐẦU*Cellulase là hệ enzyme có khả năng thủy phânliên kết β-1,4-glycoside trong phân tửcellulose tạo thành các polysaccharide mạchngắn, dextrin và glucose. Do đó, cellulase cóý nghĩa lớn và nhiều ứng dụng trong côngnghiệp và nông nghiệp [1, 2]. Cellulase đượcsinh tổng hợp bởi các chủng vi khuẩn, vi nấmvà nấm đảm. Một trong những công việc cầntiến hành khi nghiên cứu các chủng vi sinhsinh tổng hợp enzyme là phải phân loại chủngvi sinh đó. Hiện nay, để phân loại chủng visinh vật người ta có thể dựa vào những đặcđiểm hình thái, sinh lý sinh hóa và phân loạiphân tử. Trong đó, phân loại học phân tử dựavào trình tự nucleotit của gene mã hóa rRNAđang là một công cụ hữu hiệu trong phân loạivà bổ sung cho quá trình phân loại bằng cácđặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa.Gene 28S rRNA là gene mã hóa đặc trưngcho rRNA của các chủng nấm nói chung vànấm đảm nói riêng. Vùng D1, D2 trên gene28S rRNA có trình tự với độ bảo thủ cao, dođó trình tự vùng này thường được dùng trongphân loại phân tử [4]. Cặp mồi NL1, NL4được thiết kế để nhân vùng D1, D2 đã đượcnhiều tác giả sử dụng trong nghiên cứu phânloại học phân tử các chủng nấm [3, 6]. Trong*Tel: 0983 034876, Email: trinhdinhkha.tnus@gmail.comnghiên cứu này, chúng tôi công bố kết quảnhân dòng và phân tích trình tự vùng D1, D2của gene 28S rRNA của chủng nấm đảmNDVN có khả năng sinh tổng hợp cellulasephân lập ở Việt NamVẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPVật liệu- Chủng giốngChủng nấm NDVN có khả năng sinh tổnghợp cellulase phân lập từ gỗ mục được cungcấp từ bộ sưu tập chủng giống của phòng thínghiệm Sinh học – Khoa Khoa học Sự sống –Trường Đại học Khoa học – Đại học TháiNguyên. Chủng E. coli DH10B được cungcấp bởi Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme –Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa họcvà Công nghệ Việt Nam.- Hóa chấtKit nhân dòng pJET 1.2/blunt, XhoI, XbaI, T4– DNA ligase được mua từ hãng Fermentas,CMC (carboxylmethyl cellulose) từ Sigma,Peptone, cao nấm men, agarose từ Bio Basic(Canada).Phương pháp- Tách chiết DNA tổng sốChủng nấm NDVN được nuôi cấy trong môitrường PDA dịch thể sau 5 ngày thu pellet.Pellet nấm được nghiền nhanh trong ni tơlỏng thành dạng bột mịn. Mẫu được chuyển115Trịnh Đình Khá và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆvào tube 2 ml, bổ sung dung dịch phá tế bàovà 50 µl protease K (200 mg/ml) trong 3h ở56°C, thỉnh thoảng đảo nhẹ. Sau đó, mẫuđược bổ sung 200 µl dung dịch 5M potassiumacetate ủ 10 phút trong đá. Sau khi ly tâm 10phút ở 4°C với 10000 vòng/phút, dịch nổichứa DNA tiếp tục được chiết bằngchloroform : isoamyl alcohol (24:1) để loạiprotein và tủa DNA bằng 100% isopropanol.DNA được hòa trong đệm TE, pH 8,0 điện dikiểm tra và bảo quản ở -20°C [6].- Phân tích trình tự gene 28S rRNACặp mồi NL1 (5´- GCA TAT CAA TAAGCG GAG GAA AAG - 3´) và NL4 (5´GGT CCG TGT TTC AAG ACG G - 3´)được sử dụng để nhân phân đoạn gene 28SrRNA có kích thước khoảng hơn 600 bp củachủng nấm NDVN. Hỗn hợp phản ứng gồm1,5 µl DNA khuôn; 1 µl mồi mỗi loại; 2 µlMgCl2; 0,25 µl Taq polymerase; 2,5 µl đệm;nước cất khử ion đến 25 µl. PCR được tiếnhành theo chu trình: 95°C/ 5 phút, 30 chu kỳ(95°C/1 phút, 50°C/1 phút, 72°C/1 phút),72°C/10 phút.Sản phẩm PCR được lai vào vector pJET 1.2bằng T4 ligase theo kit của hãng Fermentas.Sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào E. colichủng DH10B và chọn lọc trên môi trườngLB có bổ sung ampicillin nuôi cấy ở 37°Cqua đêm. DNA plasmid được tách chiết vàtinh sạch theo phương pháp của Sambrook vàRussell (2001) [5].Trình tự gene 28S rRNA được đọc trên máyđọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 AvantGenetic Analyser. Trình tự nucleotit được xửlý và phân tích bằng phần mềm DNA star vàBlast để xác định hệ số tương đồng và dựngcây phân loại.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNTách chiết DNA tổng số và ...