Phân loại vi sinh vật bắng sinh học phân tử

Phương pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phân loại vi sinh vật bắng sinh học phân tử 2.3. Nhân gene và kỹ thuật giảitrình tự ADN. b. Giải trình tự ADN Phương pháp chính xác và đưalại nhiều thông tin nhất cho địnhdanh và định typ vi sinh vật là xácđịnh chính xác trình tự chuỗi ADNcủa một vùng quy định trên nhiễmsắc thể. Phương pháp giải trình tựADN phát triển nhanh chóng, kếtquả so sánh sự tương đồng củatrình tự gene nghiên cứu trở thànhphương pháp phân loại chuẩn theosinh học phân tử trong nghiên cứuhệ thống học và cây phả hệ ditruyền giữa các đối tượng nghiêncứu. Các gene bảo thủ được giảitrình tự làm cơ sở để xác định vị trícủa sinh vật nghiên cứu, trong khiđó các trình tự không tương đồng(khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệthóa cũng như xác định mối quan hệgiữa các cá thể gần với nhau. + Nguyên tắc: Phương pháp giải trình tự ADNtheo nguyên tắc tạo ra các mảnhADN được đánh dấu tại đầu 5’hoặc 3’. Các mảnh có các baseđánh đấu được tách ra trên gelpolyacrylamid Các mảnh đượcphân biệt về vị trí trên gel với sựsai khác chỉ với một nucleotid.Việc đánh dấu và đọc kết quả theocác kỹ thuật và phương pháp khácnhau. Việc tạo ra các mảnh ADNsai khác nhau về 1 nucleotid đượctrình bày theo 2 phương pháp:phương pháp hóa học (Maxam &Gilbert, 1997) và phương phápenzym kết thúc phản ứng chuỗi(Sanger, 1997). Ngày nay phươngpháp enzym được dùng phổ biếnhơn cả. + Phương pháp enzym kếtthúc phản ứng chuỗi của Sanger: Phương pháp kết thúc phản ứngchuỗi được thực hiện dựa trên việcnhân ADN từ sợi khuôn khi cóđoạn ADN mồi với xúc tác củaKlenow hay T7-ADN polymerasevà 4 loại deoxyribonucleotid(dNTPs). Như vậy, có 4 phản ứngđược tiến hành đồng thời và trongmỗi phản ứng thì có một loại dNTPbị thay đổi bởi một dẫn xuất để làmdừng phản ứng (ddNTP). Kết quảlà phản ứng chuỗi bị dừng đặc hiệucho mỗi một base xác định xảy ramột cách ngẫu nhiên trong mỗiphản ứng. Trình tự của ADN đượcxác định trên gel. Đầu tiên phươngpháp này được xây dựng cho xácđịnh trình tự sợi ADN đơn tạo rabằng cách tách dòng ADN vàovectơ thực khuẩn thể M13 (Sangervà cộng sự, 1978). Sau đó phươngpháp xác định trình tự sợi đôi ADNđã được Chen, William (1986) môtả khi tách dòng ADN vào plasmid.Ngày nay người ta lựa chọnphương pháp Sanger để giải trìnhtự ADN cho nghiên cứu phân loạivà xác định typ vi sinh vật thay chophương pháp hóa học. Một số lợi thế của phương phápnày ở chỗ: Phương pháp này đơngiản và không tốn nhiều thời giannhư phương pháp hóa học. Khinghiên cứu phân loại và xác địnhtyp thì các gene nghiên cứu có độbảo thủ nhất định vì vậy ta có thểdùng chung mồi cho nhiều đốitượng khác nhau. Một trong hạnchế của phương pháp này ở chỗ cácđoạn ADN cần được tách dòngtrước khi tiến hành giải trình tựADN. Tuy nhiên cho đến nayngười ta đã cải tiến phương phápnày để có thể giải trình tự trực tiếpsản phẩm PCR. + Giới thiệu kỹ thuật giải trình tự ADN theo Sanger: Có hai phương pháp: Phươngpháp giải trình tự truyền thống đọckết quả trên bản gel (đánh dấu bằngphóng xạ là chủ yếu) và phươngpháp giải trình tự và đọc kết quả tựđộng (đánh dấu bằng hóa chấthuỳnh quang). - Phương pháp truyền thống: Các bước chính cho giải trình tự ADN như sau: Chuẩn bị ADN khuôn Bắt cặp ADN khuôn và mồi Tiến hành phản ứng giải trình tự ADN Tách sản phẩm trên gel polyacrylamid biến tính với urea. Đọc kết quả. Tuy nhiên cần chú ý một sốđiểm sau: 1. Chuẩn bị ADN khuôn. 2. Điều kiện bắt cặp mồi. 3. Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN. 4. Tách sản phẩm trên acrylamid gel. 5. Đọc kết quả.Vietsciences- Dương Văn Hợp,Nguyễn Lân Dũng