phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt)

. Nhân gene và kỹ thuật giải trình tự ADN. Kỹ thuật lai ADN đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn ADN đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi các tiến hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ ADN cho các kỹ thuật lai hay...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt) 2.3. Nhân gene và kỹ thuật giảitrình tự ADN. Kỹ thuật lai ADN đã được sửdụng rộng rãi cho các nghiên cứuxác định typ của nhiều đối tượng visinh vật. Nguồn ADN đích đôi khichỉ có số lượng ít trừ khi các tiếnhành nuôi cấy vi sinh vật. Trongmột số trường hợp việc nuôi cấykhông thể thực hiện được với nhiềuloài vi sinh vật hay virút hoặc trongcác trường hợp khác cần thời giandài nuôi cấy vi sinh vật để có đủADN cho các kỹ thuật lai hay địnhtyp. Khó khăn này được khắc phụcbằng cách làm tăng nguồn ADNđích một cách nhanh chóng bằngkỹ thuật nhân gene PCR. a. Kỹ thuật nhân genePCR (Polymerase ChainReaction) Việc nhân ADN cho phép làmtăng số lượng gấp hàng triệu hoặcnhiều hơn nữa đối với đoạn ADNhay ARN nghiên cứu. Có nhiềuphương pháp khác nhau để phântích nguồn ADN khuyếch đại theocách này. Phương pháp đơn giảnnhất là sử dụng điện di để xác địnhkích thước sản phẩm của phản ứngPCR. Có thể xác định độ nhạy vàtính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩmPCR được lai với mẫu dò đặc hiệuđã được đánh dấu. Phương phápđưa lại thông tin nhiều nhất là xácđịnh được trình tự ADN và ARNcủa sản phẩm PCR. Việc xác địnhđược sai khác của chuỗi ADN sẽcho phép xác định và định typchính xác nhất các đối tượng visinh vật nghiên cứu. Kết quả xácđịnh trình tự ADN còn cho phépxác định mối liên hệ tiến hoá vàdịch tễ học của các chủng vi sinhvật. - Đôi nét về phản ứng chuỗiPCR: Phản ứng chuỗi PCR nhằmkhuyếch đại ADN lần đầu tiênđược Saki (1985) giới thiệu và đâyđược coi là một trong những tiếnbộ khoa học quan trọng nhất vềsinh học trong thập kỷ 80. Phảnứng PCR sử dụng enzym chịu nhiệttạo ra nhiều phiên bản theo hàm sốmũ. Có thể ví dụ, chỉ cần 1 sợiADN sau vài giờ có thể nhân lên1011 phiên bản ADN tương đươngvới 100 ng ADN. Sau khi thực hiệnphản ứng PCR thì cần tiến hànhmột số kỹ thuật để xác định sảnphẩm, đơn giản nhất là điện di vàxác định kích thước của sản phẩmPCR. Trong các nghiên cứu chẩnđoán thì kết quả này rất có ý nghĩa,nó chứng tỏ sự có mặt của ADNđích trong mẫu nghiên cứu. Có thểnhận được tính đặc hiệu và độ nhạycao hơn khi sử dụng kỹ thuật RFLPvới sản phẩm PCR hoặc lai vớimẫu dò đặc hiệu. Tuy nhiên, thôngtin đầy đủ nhất vẫn là kết quả xácđịnh trình tự ADN của sản phẩmPCR. Ngay từ khi được giới thiệuthì PCR đã được xem là phươngpháp đưa lại kết quả khá nhạy trongviệc xác định và phát hiện vi sinhvật. Tính ưu việt của nó thể hiện ởchỗ có thể chỉ cần một hạt virushay một tế bào vi khuẩn nào đócũng đủ cho phản ứng xảy ra vàkhuyếch đại tới mức có thể pháthiện được trong thời gian ngắn. Kỹthuật PCR còn được dùng để nhânADN từ khuôn RNA sau khi đãđược chuyển thành cDNA sau phảnứng phiên mã ngược (RT). Phươngpháp này nhanh chóng được chú ývà trở lên phổ biến cho các nghiêncứu phát hiện vi khuẩn hay virus ởnồng độ thấp trong các mẫu môitrường và bệnh phẩm. Ví dụ việcphát hiện mẫu máu nhiễm HIV cónghĩa là phát hiện phần nhỏ ADNcủa virus trong hệ gene người cókích thước gấp 100 000 lần. Mặtkhác khi dùng kỹ thuật miễn dịchvới kháng thể thì phải cần tới 8ngày mới có đáp ứng miễn dịchtrong máu, trong khi đó với kỹthuật PCR thì toàn bộ quy trìnhphát hiện chỉ mất vài giờ (đối vớinguồn ADN hay RNA). Lợi thế củakỹ thuật PCR được tận dụng choviệc chuẩn bị ADN làm mẫu dò vớisố lượng lớn cho các phép lai ADNđã trình bày ở trên. Các mẫu dò cóthể được đánh dấu bằng phóng xạhay phi phóng xạ khi tiến hànhphản ứng khuyếch đại. Mẫu dòđánh dấu với kỹ thuật PCR có ưuthế hơn các phương pháp đánh dấutruyền thống bằng kỹ thuật tổnghợp các mạch đứt gãy (nicktranslation) hay đánh dấu với mồingẫu nhiên (rADN random primerlabeling). Các ưu thế này có thể kểđến, cụ thể như là cần lượng nhỏsợi ADN khuôn, có thể tiến hànhđánh dấu với các mẫu dò có kíchthước ngắn, chuẩn bị mẫu dò khôngcần tinh sạch ADN khuôn. Bảng1.7. dưới đây liệt kê một số ví dụứng dụng kỹ thuật PCR cho pháthiện nhiều đối tượng vi sinh vậtkhác nhau. Rất nhiều các kết quảnghiên cứu như vậy được trình bàytrong các tạp chí chuyên ngànhnhư: ành như: ành như: ànhnhư: Journal of ClinicalMicrobiology, AppliedEnvironmental Microbiology.Bảng 1.7. Một số ví dụ về ứng dụngkỹ thuật PCR trong xác định vi sinhvât.Vi sinh vật Tài liệuAcanthamoeba sp Vokin et alBordetella pertussis (1992)Borrelia burgdorferi Houard et al (1989)Brucella sp MarconiCandida albicans ADN GaronCarnobacterium spp (1992)Chlamydia Herman antrachomatis DeriderClostridium difficile (1992)Coxiella burneti Miyakawa et al (1992)Cryptosporidiumparvum Brook et al (1992)Cytomegalovirus Hayes et alDengue virus (1992)Epstein-barr virus GumerlockErwinia amylovora et al (1991)Escherichia c ...