PHÂN TÍCH PROTEIN

Việc phân lập và tinh sạch được các loại protein riêng rẽ có ý nghĩa quyết địnhđến khả năng tìm hiểu được chức năng của chúng. Mặc dù trong một số trườnghợp, chúng ta có thể nghiên cứu chức năng của protein ở dạng hỗn hợp phứctạp, nhưng phần lớn những nghiên cứu này thường dẫn đến những kết luận “mùmờ”.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
PHÂN TÍCH PROTEIN1. Chuẩn bị dịch chiết tế bào để tinh sạch proteinViệc phân lập và tinh sạch được các loại protein riêng r ẽ có ý nghĩa quy ết đ ịnhđến khả năng tìm hiểu được chức năng của chúng. Mặc dù trong m ột s ố tr ườnghợp, chúng ta có thể nghiên cứu chức năng của protein ở dạng h ỗn h ợp ph ứctạp, nhưng phần lớn những nghiên cứu này th ường dẫn đ ến nh ững k ết lu ận “mùmờ”.Chẳng hạn như khi chúng ta nghiên cứu về ho ạt tính c ủa m ột enzym ADNpolymerase trong một hỗn hợp protein thô (chẳng hạn t ừ d ịch phân gi ải t ế bào),các enzym ADN polymerase và protein thành phần khác cũng có th ể ảnh h ưởngđến hiệu suất tổng hợp ADN quan sát được trong thực nghi ệm. Vì v ậy, vi ệc tinhsạch các protein là một bước quan trong trong quá trình tìm hi ểu v ề ch ức năngcủa chúng.Mỗi một protein thường có một số đặc tính riêng làm vi ệc tinh s ạch chúngthường có tính đặc thù. Điều này thì trái ng ược v ới ADN, v ốn c ơ b ản gi ống nhauvề cấu trúc và thành phần, chỉ khác nhau về trình t ự c ủa các nucleotit. Cácbước tinh sạch từng loại protein thường dựa trên các đặc tính đ ặc thù c ủa nó v ềkích thước, hình dạng, điện tích và nhiều khi là ch ức năng c ủa chúng.Vật liệu khởi đầu cho hầu hết các quá trình tinh sạch protein t ừ sinh v ật là cácdịch chiết tế bào. Không giống ADN vốn có tính ph ục h ồi cao trong các đi ềukiện nhiệt độ sống khác nhau, thì protein r ất dễ b ị bi ến tính và phá h ủy sau khibị giải phóng ra khỏi tế bào. Vì lý do này, h ầu h ết quá trình chu ẩn b ị các d ịchchiết và tinh sạch protein được tiến hành ở nhiệt đ ộ lạnh (4oC). Có m ột s ố cáchchuẩn bị dịch chiết tế bào. Các tế bào có thể phân gi ải bằng s ử d ụng chất t ẩy,các lực làm vỡ thành tế bào, xử lý với dung dịch nh ược tr ương (làm t ế bàotrương lên do nước đi vào và vỡ ra), hoặc thay đ ổi đ ột ng ột áp su ất. Đi ểm chungcủa tất cả các phương pháp là làm thành t ế bào v ỡ ra và các protein đ ược gi ảiphóng. Trong một số trường hợp, các tế bào đ ược chuy ển v ề tr ạng thái đônglạnh trước khi được nghiền bằng những máy nghiền mẫu trong phòng thínghiệm.2. Sử dụng sắc ký cột trong tinh chế proteinPhương pháp chiết xuất và tinh sạch protein ph ổ bi ến nhất là sắc ký c ột. Trongtrường hợp này, các phân đoạn protein đ ược cho ch ạy qua c ột nh ồi b ằng cáchạt agarose hoặc polyacrylamit nhỏ được cải biến cho phù h ợp. Có m ột s ốphương án khác nhau trong việc sử dụng cột tách chi ết và tinh s ạch protein.Các quy trình khác nhau được thiết lập có thể khác nhau do đ ặc tính khác nhaucủa các loại protein. Ở đây mô tả ba phương pháp. Trong hai ph ương pháp đ ầu,protein được phân lập dựa vào kích thước và tính tích đi ện c ủa chúng. Tóm t ắtvề các phương pháp này được nêu trên hình 14.Sắc ký trao đổi ion: Trong phương pháp này, các phân t ử protein đ ược phân l ậpdựa trên điện tích ion hóa bề mặt của chúng b ằng vi ệc s ử dụng các v ật li ệu làmcột là các hạt mang các nhóm chức tích đi ện âm ho ặc d ương (đây còn đ ược g ọilà pha tĩnh). Các phân tử protein tương tác yếu v ới các h ạt (ch ẳng h ạn nh ư m ộtphân tử protein tích điện dương được cho chạy qua c ột mang các h ạt tích đi ệnâm) sẽ được hồi lưu khi sử dụng một dung dịch muỗi loãng ch ảy qua c ột sau đó(dung dịch chạy mẫu được gọi là pha động). Các phân t ử t ương tác v ới phađộng càng mạnh, càng cần dung dịch hàm l ượng mu ối cao đ ể h ồi l ưu m ẫu (b ởimuối làm trung hòa các vùng mang điện tích và vì vậy cho phép các phân t ửprotein được giải phóng khỏi cột. Bằng việc tăng d ần n ồng đ ộ mu ối trong cácdung dịch đệm thu hồi mẫu, các phân t ử protein khác nhau, k ể c ả các phân t ửcó đặc tính tích điện gần giống nhau cũng được phân tách thành các phân đo ạnkhác nhau khi chúng được hồi lưu từ cột.Sắc ký lọc gel: Kỹ thuật này cho phép phân tách các lo ại protein trên c ở s ở đ ặcđiểm khác nhau của các loại protein về hình dạng và kích thước. Khác v ới trongkỹ thuật sắc ký trao đổi ion, các hạt được sử dụng để nh ồi c ột trong k ỹ thu ậtnày không mang các nhóm tích điện mà thay vào đó là mang các l ỗ có kíchthước khác nhau. Các phân tử protein càng nh ỏ càng có nhi ều kh ả năng thâmnhập vào tất cả các lỗ; vì vậy, thời gian chạy qua cột dài h ơn và th ời gian h ồilưu muộn hơn. Ngược lại, các phân tử protein kích th ước càng l ớn càng có th ờigian hồi lưu (chạy qua toàn bộ cột) sớm hơn.Đối với mỗi loại cột, các phân đoạn sắc ký đ ược thu ở các n ồng đ ộ mu ối khácnhau hoặc ở các thời gian hồi lưu khác nhau để thu đ ược t ừng lo ại protein đ ượcquan tâm nghiên cứu. Các phân đoạn có hoạt tính protein đ ược quan tâm caonhất sẽ được tích lũy và tiến hành tinh sạch bổ sung.Độ tinh sạch của sản phẩm protein sẽ tăng lên khi các phân đo ạn protein đ ượcchạy qua nhiều cột sắc ký khác nhau. Thông th ường m ột c ột sắc ký đ ơn l ẻkhông đủ để tinh sạch được một loại phân tử protein mong mu ốn nào đó dù quátrình sắc ký được lặp đi lặp lại nhiều lần, thay vào đó ng ười ta th ường ph ải ápdụng ...