Phát hiện người lành mang gen bệnh Hemophilia A

Bài viết Phát hiện người lành mang gen bệnh Hemophilia A trình bày Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu, di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định người lành mang gen bệnh để thực hiện tư vấn di truyền, góp phần ngăn ngừa và giảm tỷ lệ mắc bệnh, tránh hậu quả nặng nề cho gia đình bệnh nhân và xã hội,.. Mời các bạn cùng tham khảo.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện người lành mang gen bệnh Hemophilia A TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A Bùi Thị Thu Hương1, Trần Vân Khánh1, Nguyễn Viết Tiến2, Nguyễn Thị Hà1, Tạ Thành Văn1 1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Phụ sản Trung ương Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu, di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định người lành mang gen bệnh để thực hiện tư vấn di truyền, góp phần ngăn ngừa và giảm tỷ lệ mắc bệnh, tránh hậu quả nặng nề cho gia đình bệnh nhân và xã hội. Trong nghiên cứu này, 7 thành viên nữ trong 5 gia đình bệnh nhân hemophillia A được lựa chọn nghiên cứu; Sử dụng kỹ thuật Inversion PCR và giải trình tự gen để xác định tình trang mang gen bệnh. Kết quả phát hiện được 4/7 trường hợp là người lành mang gen bệnh ở dạng dị hợp tử. Từ khóa: Hemophilia A, người lành mang gen bệnh I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh hemophilia (hay bệnh ưa chảy máu) bệnh nhân, chẩn đoán trước sinh trên những là một bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thai phụ có nguy cơ cao giúp tư vấn hôn nhân thường chức năng của các yếu tố đông máu và tư vấn di truyền, là biện pháp cơ bản để huyết tương: yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A, ngăn ngừa và giảm tỷ lệ sinh con mắc bệnh, yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, yếu tố XI hạn chế tỷ lệ mắc bệnh chung cho cộng đồng. gây bệnh hemophilia C. Bệnh hemophilia A Ở Việt Nam, năm 2004 Lê Nhật Minh và phổ biến nhất, chiếm khoảng 85%, bệnh hemophilia B chiếm 15 ÷ 20% các trường hợp mắc bệnh hemophilia [1; 2]. cộng sự nghiên cứu phát hiện người lành mang gen bệnh của 9 gia đình có con mắc bệnh hemophilia A, sử dụng kỹ thuât cắt en- Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên zym giới hạn (PCR - RFLP), tác giả đã phát quan đến giới tính, gen bệnh nằm trên nhiễm hiện được 44,44% người mẹ mang gen bệnh, sắc thể X. Người mẹ mang gen bệnh có khả còn lại trên 50% không phát hiện được [4]. năng truyền bệnh cho 50% con trai của họ, do vậy chủ yếu bệnh nhân là nam. Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/4.000 ÷ 1/5.000 trẻ trai. Tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A ở các nước khác nhau nhưng có tần suất chung khoảng 30 ÷ 100/1.000.000 dân [3]. Có nhiều dạng đột biến trên gen F8 gây bệnh hemophilia A như: đột biến đảo đoạn intron 1, đảo đoạn intron 2, đột biến điểm... Để phát hiện các dạng đột biến gen cần phải sử dụng các kỹ thuật khác nhau cho từng dạng đột biến cụ thể. Cho đến nay, ở Việt Nam Nghiên cứu phát hiện người lành mang chưa có một nghiên cứu nào phân tích trực gen bệnh (mẹ, chị và em gái) trong gia đình tiếp và toàn diện các dạng đột biến gen F8 trên bệnh nhân hemophilia A, đặc biệt là phát Địa chỉ liên hệ: Tạ Thành Văn, trung tâm Gen - Protein, trường Đại học Y Hà Nội Email: tathanhvan@hmu.edu.vn Ngày nhận: 17/4/2013 Ngày được chấp thuận: 20/6/2013 TCNCYH 83 (3) - 2013 hiện người lành mang gen bệnh. Vì vậy, đề tài nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu: Phát hiện người lành mang gen F8 đột biến gây bệnh hemophilia A. 1 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP có đột biến mất 3 nucleotid bằng kỹ thuật giải trình tự gen). 1. Đối tượng Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y - Nhóm chứng: 5 người nam bình thường khỏe mạnh. Hà Nội. - Nhóm nghiên cứu: 7 thành viên nữ trong 5 gia đình bệnh nhân hemophillia A đã được Đột biến phát hiện được ở bệnh nhân là đột biến chỉ điểm cho việc phát hiện trạng thái xác định có đột biến gen F8 (bao gồm 01 bệnh mang gen bệnh của người mẹ và các thành nhân thể nặng có đột biến đảo đoạn intron 22 bằng phương pháp I-PCR, 03 bệnh nhân thể viên nữ trong gia đình. trung bình và nhẹ có đột biến điểm bằng kỹ thuật giải trình tự gen, 01 bệnh nhân thể nặng 2. Phương pháp 2.1. Mô hình nghiên cứu 2.2. Tách chiết DNA Ủ 41 µl hỗn hợp trên ở nhiệt độ 160C qua đêm + DNA được tách chiết theo phương pháp → Tinh sạch sản phẩm thu được bằng cột GFXTM theo quy trình của hãng Amersham → phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi của bệnh nhân và người nhà bệnh nhân (mẹ, dì, chị gái). + Kiểm tra độ tinh sạch của DNA được tách chiết: bằng phương pháp đo quang, dựa vào tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0. 2.2.3. Xác định đột biến gen F8 Pha loãng sản phẩm thu (DNA đã đóng vòng) trong 20 µl H2O. + Khuếch đại bằng phản ứng multiplexPCR: Tổng thể tích 20 µl bao gồm: H2O 12,0 µl, buffer 10X 2 µl, dNTPs 1,0 µl , DNA 3,0 µl, Extaq 0,5 µl, các mồi: IU 0,5 µl, ID 0,5 µl , ED - Kỹ thuật I - PCR (Inversion - PCR) xác định đột biến đảo đoạn của Rosetti và cộng sự 0,5 µl. Chu kỳ nhiệt phản ứng multiplex - PCR: năm 2005 [5]. Quy trình gồm 3 bước: + Cắt bằng enzym BclI. 940C/2 phút; [940C/12 giây, 600C/30 giây, 720C/7 phút] x 35 chu kỳ; 720C/5 phút. Thành phần phản ứng: 1,5 µg DNA, H2O 25,5 µl, Buffer 10X 3µl, enzym BclI 1,5 µl - Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột (Promega). Ủ 370C/4 giờ → Tinh sạch bằng biến điểm Sử dụng 38 cặp mồi được thiết kế bao phủ phenol chloroform. + Nối bằng T4 ligate t ...