Phát hiện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra Việt Nam bằng kỹ thuật PCR

Bài viết này đề cập đến phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) khuếch đại DNA với độ đặc hiệu và độ nhạy cao được ứng dụng để phát hiện nhanh vi khuẩn E. ictaluri. Các mồi được thiết kế để khuếch đại đoạn gen eip18 có kích thước khoảng 480 bp trong DNA genome của E. ictaluri.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra Việt Nam bằng kỹ thuật PCRTạp chí Công nghệ Sinh học 9(1): 61-65, 2011PHÁT HIỆN VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA VIỆTNAM BẰNG KỸ THUẬT PCRTrần Thị Thanh Huyền1, Nguyễn Thị Trung2, Trương Nam Hải212Trường ðại học Khoa học tự nhiên, ðại học Quốc gia Hà NộiViện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt NamTÓM TẮTHiện nay, cá Tra và cá Basa bị nhiễm bệnh ñốm trắng nội tạng ñang trở nên phổ biến ở Việt nam. Vi khuẩnEdwardsiella ictaluri là một trong các tác nhân gây ra bệnh gan thận mủ ở cá Tra. Tác nhân này ñe dọa nghiêmtrọng ñến sự phát triển bền vững và giá trị kinh tế của ngành Thủy sản. Việc phát hiện ra vi khuẩn này sớm rất cóý nghĩa quan trọng trong việc quản lý bệnh cá Tra không chỉ ở Việt Nam mà cả ở các nước trên thế giới. Bài báonày ñề cập ñến phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) khuếch ñại DNA với ñộ ñặc hiệu và ñộ nhạy caoñược ứng dụng ñể phát hiện nhanh vi khuẩn E. ictaluri. Các mồi ñược thiết kế ñể khuếch ñại ñoạn gen eip18 cókích thước khoảng 480 bp trong DNA genome của E. ictaluri. Các kết quả nhận ñược chỉ ra rằng kĩ thuật PCR sửdụng cặp mồi thiết kế ñã khuếch ñại ñoạn DNA có kích thước khoảng 480 bp từ DNA genome vi khuẩn E.ictaluri, nhưng không khuếch ñại ñối với DNA genome của vi khuẩn E. tadar và một số tác nhân gây bệnh khácnhư: E. coli, Proteus, Salmonella. Kỹ thuật này có khả năng khuếch ñại ñoạn DNA khi mật ñộ E. ictaluri khoảng3 cfu/ml. Như vậy, có thể sử dụng kĩ thuật PCR khuếch ñại gen eip18 ñể phát hiện nhanh E. ictaluri.Từ khóa: cá Tra, Edwardsiella ictaluri, eip18, PCRMỞ ðẦUCho ñến nay, một số tác giả công bố các kết quảnghiên cứu về bệnh gan thận mủ trên cá Tra và cáBasa ñã kết luận rằng vi khuẩn E. ictaluri là mộttrong những tác nhân gây ra bệnh mủ gen ở cá Travà cá Basa Việt Nam. Vi khuẩn E. ictaluri (thuộc họEnterbacteriaceae) là vi khuẩn gram âm, hình que,không sinh bào tử, yếm khí tùy tiện, phản ứngcatalase dương tính, oxidase âm tính. Hiện nay, bệnhdo vi khuẩn Edwardsiella ñã và ñang gây thiệt hạilớn cho người nuôi cá thâm canh ở các tỉnh ñồngbằng sông Cửu Long. Tỷ lệ cá chết khi bị nhiễmbệnh gan thận mủ có thể lên ñến 90%. Việc tăngdiện tích, mức ñộ thâm canh cao, không có biện phápxử lý nguồn nước ao nuôi trước khi thải ra môitrường làm lây lan nhanh mầm bệnh. Việc phát hiệnsớm cá, môi trường nước bị nhiễm vi khuẩn E.ictaluri là vô cùng cần thiết ñể từ ñó có hướng xử lýkịp thời, tránh gây thiệt hại nặng nề về kinh tế chongười nuôi trồng thủy sản.Thông thường, vi khuẩn có thể ñược phát hiệnbằng phương pháp nuôi cấy và xác ñịnh các ñặc tínhsinh hóa trong phòng thí nghiệm nhưng phải mất ítnhất 3 tuần ñể kết luận tác nhân gây bệnh (Panangalaet al., 2005). ðặng Thị Hoàng Oanh và ðặng ThụyMai Thy (2009) công bố một quy trình PCR khuếchñại một ñoạn DNA 407 bp nằm trong vùng 16SrRNA ñể phát hiện vi khuẩn E. ictaluri. Do ñó, việcphát hiện vi khuẩn này bằng kĩ thuật PCR ñược môtả sau ñây sẽ rất nhanh chóng và ñặc hiệu, cho phépngười nuôi cá có thể có hướng xử lý kịp thời khiphát hiện cá bị nhiễm khuẩn. Phản ứng khuếch ñạigene (PCR) là một phương pháp cơ bản, nhanh vànhạy ñể phát hiện ra vi sinh vật trong mẫu bệnhphẩm cá và mẫu nước môi trường bị nhiễm mầmbệnh dựa trên việc khuếch ñại gen eip18 ñặc trưngcủa vi khuẩn E. ictaluri bằng cặp mồi ñặc hiệu.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPVật liệuVi khuẩn E. ictaluri ATCC 33202, E. tardaATCC 15469 mua từ Bảo tàng giống chuẩn củaðức. Vi khuẩn E. ictaluri phân lập dựa vào phươngpháp nuôi cấy truyền thống và các ñặc ñiểm sinhhóa kí hiệu là E5, E7, E40 ñược sử dụng ñể làm ñốichứng vi sinh E. ictaluri chủng Việt Nam. Vi khuẩnEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,Salmonella Typhimurium, S. Enteritidis, Proteusmirabilis là chủng chủng thí nghiệm ñang ñược sửdụng tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệsinh học và một chủng E10 (ñược cho làAeromonas hydrophila) ñược sử dụng ñể làm ñốichứng âm trong thí nghiệm xác ñịnh ñộ ñặc hiệucủa kĩ thuật.61Trần Thị Thanh Huyền et al.Phương phápTách chiết DNA genome của vi khuẩnVi khuẩn sau khi ñược nuôi trong môi trườngBHIB ở 28oC trong 18 h, thu sinh khối. Chuyển 1,5ml dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf và ly tâm 5000vòng/phút trong 7 phút thu tế bào. Tế bào ñược hòatan trong 0,5 ml ñệm TE (10 mM Tris-HCl, 1 mMEDTA, pH 8), ly tâm thu tế bào (Krystal et al.,2003). Bổ sung 0,5 ml TE, 3 µl RNAse, 2 µllysozyme, trộn ñều và ñể nhiệt ñộ phòng trong 30phút. Thêm 30 µl SDS 10%, 3 µl proteinase K trộnñều ủ 37oC trong 60 phút. Bổ sung 180 µl 5 M NaCl,ủ 65oC trong 10 phút, ly tâm thu dịch nổi ở trên.Chiết DNA hai lần bằng hỗn hợp Phenol:Choloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1), ly tâm thupha trên. DNA genome ñược tủa trong 70% cồn ở –20oC trong 30 phút. Ly tâm thu tủa và làm khô, sauñó bổ sung 40 µl TE ñể hòa tan DNA genome. ðiệndi kiểm Tra sản phẩm DNA genome sau tách chiếttrên gel 0,8% agaros ...