Phát triển hệ thống tái sinh in vitro cây đậu tương (glycine max (l.) merill) phục vụ chuyển gen

Trong quá trình nghiên cứu hệ thống tái sinh cây in vitro từ đốt lá mầm của hai giống đậu tương ĐT12 và ĐT84, đã cho thấy cả hai giống đều có khả năng tạo đa chồi và tạo cây hoàn chỉnh. Khi tạo cảm ứng đa chồi thì nồng độ BAP thích hợp là 1mg/l và khi gây tổn thương có khả năng tạo đa chồi cao.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát triển hệ thống tái sinh in vitro cây đậu tương (glycine max (l.) merill) phục vụ chuyển gen52(4): 89 - 93Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ4 - 2009PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG(Glycine max (L.) Merill) PHỤC VỤ CHUYỂN GENNguyễn Thị Thuý Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu (Đại học Thái Nguyên)Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (Viện Công nghệ Sinh học)Tóm tắtHai giống đậu tương ĐT12 và ĐT84 đã được sử dụng trong nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro từ đốt lámầm. Hạt đậu tương sau khi thu hoạch được nuôi cấy trên môi trường GM: 3052mg/l muối B 5; 10ml MS IV;30g/l sucrose; 0,6369 g/l MES, pH 5,8; 6,5g/l agar, vitamin B5 1X. Sau 3 ngày hạt nảy mầm có màu xanh cắtbỏ phần trụ rễ, tách đôi lá mầm thành hai mẫu riêng biệt cấy chuyển sang môi trường tạo cảm ứng chồi (môitrường SIM): 3052mg/l muối B5; 10ml MS IV; 30g/l sucrose; 0,6369 g/l MES, pH 5,6; 6,5g/l agar, vitamin B51X; BAP (1mg/l, 1,5mg/l, 1,67mg/l).Sau 4 tuần cấy chuyển cụm chồi sang môi trường kéo dài chồi (môi trường SEM): 3052mg/l muối B5;10ml MS IV; 30g/l sucrose; 0,6369 g/l MES, pH 5,6, 6,5g/l agar; GA3 0,5ml/l (stock 1), zeatin riboside (ZR):1mg/l, L – asparagine: 50mg/l, L- pyro glutamic acid: 100mg/l; vitamin B5 1X, IAA: 0,1mg/l. Khi các chồidài 5 – 7cm tách riêng từng chồi cấy chuyển sang môi trường ra rễ (môi trường RM): 1,58g/l MS; 20g/lsucrose; 0,58g/l MES; 1mg/l IBA, pH 5,6; agar: 6,5g/l, vitamin B5 1X. Khi cây có rễ hoàn chỉnh (lá xanh vàbộ rễ phát triển) được ra bầu và đưa ra trồng ở nhà lưới. Trong quá trình nghiên cứu hệ thống tái sinh cây invitro từ đốt lá mầm của hai giống đậu tương ĐT12 và ĐT84, đã cho thấy cả hai giống đều có khả năng tạo đachồi và tạo cây hoàn chỉnh. Khi tạo cảm ứng đa chồi thì nồng độ BAP thích hợp là 1mg/l và khi gây tổnthương có khả năng tạo đa chồi cao.Từ khóa: Đa chồi, đậu tương, Glycine max, in vitro, đốt lá mầm, hệ thống tái sinh.I. MỞ ĐẦUCây đậu tương là cây công nghiệp ngắn ngàycó giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Hạt đậu tươngchứa 40-50% protein, 18-25% lipit, 36-40%hydratcacbon và các loại axit amin cần thiết chocơ thể con người như: xitstein, lizin, triptophan,lơxin, metionin. Ngoài ra trong hạt đậu tương cònchứa nhiều loại vitamin cần thiết cho cơ thể ngườivà động vật.Tạo giống đậu tương mới có năng suất cao,kháng bệnh, chống chịu tốt với các điều kiện bấtlợi luôn được các nhà tạo giống quan tâm. Bêncạnh các phương pháp truyền thống đã và đangđược sử dụng, phương pháp tạo giống mới bằng kỹthuật gen di truyền cũng đang là phương phápmang lại hiệu quả cao trong công tác tạo giống đậutương với các tính trạng mong muốn (Krishnan,2005) [2]. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tươngđã được thực hiện nhờ vi khuẩn Agrobacterium vớiTi-plasmid qua đốt lá mầm (Chee và cs, 1989;Donaldson and Simmonds, 2000) [1], [6] hoặc phôixoma (Yoichi Kita, 2007) [8]... và cho đến naytheo thống kê của USDA, diện tích trồng cây đậutương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ chiếm 81%ở Mỹ; 99,1% ở Argentina và 34% ở Brazil(Letster, 2004) [3]. Tuy nhiên, ở Việt Nam, tạogiống đậu tương mới bằng kỹ thuật chuyển genmới chỉ bắt đầu được quan tâm nghiên cứu.Đậu tương là đối tượng thực vật rất khó thựchiện nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo môsẹo, tái sinh cây, tạo rễ và ra cây. Tái sinh in vitroở cây đậu tương có thể được thực hiện từ phôixoma, phôi non và đốt lá mầm [1], [6], [8]. Kỹthuật tái sinh từ đốt lá mầm có ưu điểm về khảnăng tái sinh và cho ra chồi cao, thời gian từ khibắt đầu cho đến khi ra cây được rút ngắn đáng kểcòn khoảng 3 tháng (Olhoft và cs, 2003) [5].Thành công của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thựcvật phụ thuộc nhiều vào sự lựa chọn môi trườngdinh dưỡng, tỷ lệ các chất điều hoà sinh trưởng và152(4): 82 - 88Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆcác yếu tố khác. Nhu cầu dinh dưỡng cho sinhtrưởng tối ưu ở các loài và giữa các bộ phận cơ thểkhông giống nhau (Murashige và Skoog, 1962; VũVăn Vụ, 1999) [4], [7]. Môi trường dinh dưỡng cơbản bao gồm muối vô cơ (NO-3, NH4+....), nguồn cacbon (đường sacarose, mantose, glucose, galactose...),vitamin (B1, B5...), và các chất điều hoà sinh trưởng.Ngoài ra, người ta có thể bổ sung các thành phầnkhác như hợp chất nitơ hữu cơ, axit hữu cơ và dịchchiết từ thực vật tuỳ theo mục đích nuôi cấy.II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP1.Nguyên liệuHai giống đậu tương ĐT12 và ĐT84 do Trungtâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ - Viện Khoahọc Nông nghiệp Việt Nam cung cấp, hai giốngnày có thể trồng 3 vụ trong năm, có nhiều ưu điểm,thời gian sinh trưởng ngắn, độ thuần khá, năng suấtđạt 2-2,3 tấn/ha, có thể trồng đại trà.Nuôi cấy in vitro được thực hiện trong điềukiện dưới ánh sáng đèn neon trong phòng nuôi cấyvới cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24giờ, nhiệt độ phòng nuôi 250C ± 10C.2.Phương pháp nghiên cứuTạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro : hạt của cácgiống đậu tương thu nhập được gieo trồng . Theodõi thời gian sinh trưởng, ra hoa kết quả của cácgiống, khi hạt chín thu cắt quả chín (qua các thínghiệm chúng tôi nhận thấy các hạt khi vừa đến lúcthu hoạch làm thí nghiệm cho tỷ lệ nảy mầm là100%).Khử trùng hạt: Bóc vỏ, chọn những hạt to, mẩykhông bị nứt vỏ đem tráng nước vô trùng hai lầnsau đó rửa cồn trong vòng 1 phút, làm lại hai lần,sau đó tráng sạch hạt bằng nước vô trùng, lắc hạtvới dung dịch Javen trong vòng 20 phút, đảo, lắcthật đều, tráng sạch hạt bằng nước vô trùng nhiều4 - 2009Môi trường nảy mầm hạt (GM): Ngâm hạt trongnước cất 2 giờ sau đó cấy vào bình tam giác trongmôi trường GM : Muối B5 + 30g/l sucrose + 6,5g/laga, PH = 5,8. Khảo sát khả năng nảy mầm hạt sau0, 1, 2, 3, 4, 5 ngày. Sau thời gian khoảng 2-3 ngàykhi hạt đã nảy mầm chuyển sang mầu xanh theodõi tỷ lệ nảy mầm.Môi trường cảm ứng tạo đa chồi: Sau khi hạt nảymầm dùng dao giải phẫu cắt bỏ phần lớn trụ rễ,chừa lại khoảng 3-5 mm cách từ nốt lá mầm xuống,tách đôi lá mầm thành hai mẫu cấy riêng biệt, cắtbỏ phần lá mầm, theo dõi tạo ...