PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU ACID NUCLEIC

Tạo mẫu dò cho lai phân tử để xác nhận sự hiện diện của yếu tố đặc hiệu của sinh vật đích dựa vào đặc tính bắt cặp bổ sung của acid nucleic.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU ACID NUCLEIC BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP. HỒ CHÍ MINH Viện: Công Nghệ Sinh Học và Thực Phẩm Bộ môn: Hóa sinh động vật  GVHD: Th.S Trần Hồng BảoQuyênDANH SÁCH NHÓM TT HỌ TÊN SINH VIÊN 1 Trương Văn Hiền 2 Nguyễn Xuân Giang 3 Hoàng Thị Lộc 4 Trương Thị Thúy Nga 5 Mai Nguyễn Bảo Ngân 6 Bùi Thị Hồng Ngọc 7 Nguyễn Kiều Oanh NỘI DUNG CHÍNHI. Mục đích đánh dấuII. Tác nhân đánh dấuIII. Phương pháp đánh dấuIV. Các enzyme tham gia I. MỤC ĐÍCH ĐÁNH DẤUTạo mẫu dò cho lai phân tử để xác nhận sựhiện diện của yếu tố đặc hiệu của sinh vậtđích dựa vào đặc tính bắt cặp bổ sung củaacid nucleic. II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU2.1. BẰNG ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ2.1.1. Nguyên tắc làm việcVới phương pháp đánh dấu bằng đồng vị phóngxạ, người ta thường dùng 32P, 35S, 3H phát ra tiaBeta năng lượng cao. Việc phát hiện các mẫu dòđược tiến hành nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi. II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU2.1. BẰNG ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ2.1.2. Ưu – nhược điểmƯu điểm:  Có độ nhạy cao  Cho tín hiệu mạnh với thời gian phơi sáng ngắnNhược điểm:  Có hại cho sức khỏe của con người  Đòi hỏi nhiều biện pháp an toàn, tốn kém trong thao tác và xử lí chất thải.  Các mẫu dò không dùng được trong thời gian dài do chu kì bán rã của các đồng vi phóng xạ. II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU2.2. BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC2.2.1. Sử dụng avidine – biotine:Avidine được gắn với một nhóm phát huỳnhquang hay một enzim xúc tác cho phản ứng tạomàu.Biotine được gắn vào DNA nhờ phản ứng hóahọc hoặc DNA được tổng hợp từ những nucleotidecó gắn biotine II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU2.2. BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC2.2.1. Sử dụng avidine – biotine:Sau đó, biotine hiện diện trong phân tử lai đượcphát hiện khi cho ligand của nó là avidine vào phảnứng. Kết quả là những tín hiệu màu nhận đượctrên màng lai. II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU2.2. BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC2.2.2. Dựa trên sự phát quang sinh học:Đầu tiên mẫu dò được đánh dấu bằng peroxidaseSau đó cho tiếp xúc với một cơ chất củaperoxidase có khả năng phát sáng khi bị biến đổi.Ánh sáng sẽ phát sáng lên phim và kết quả thunhận là những chấm trên phim. II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU2.2. BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC2.2.3. Ưu – nhược điểm:Ưu điểm:  Không gây hại cho sức khỏe của con người,  Ít tốn kémNhược điểm: độ nhạy kém III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU3.1. PHƯƠNG PHÁP NICK – TRANSLATION III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH D Ấ U3.2. PHƯƠNG PHÁP RANDOM PRIMING III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH D Ấ U3.3. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU CÁC OLIGONUCLEOTIDE III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH D Ấ U3.4. PHƯƠNG PHÁP TẠO MẪU DÒ RNA (a)Gắn DNA vào vùng PCS (b)Cắt plasmid ở vị trí ngay sau đoạn gene (so với promoter định sử dụng), tạo dạng thẳng (c)Thêm SP6 hoặc T7 RNA pol và các nucleotide tự do, trong đó có 1 loại nucleotide đánh dấu (d)Chọn lại các phân tử đánh dấu có trình tự và kích thước mong muốnIV. CÁC ENZYME THAM GIADNAse I có tác dụng:•Loại DNA tạp nhiễm trong các phân đoạn RNA hay protein•Tạo các chỗ đứt (nick) trên DNA trong kĩ thuật đánh dấumẫu dò kiểu Nick – translation.•Phát hiện các gen hoạt động trên nhiễm sắc chất.IV. CÁC ENZYME THAM GIADNA polymerase I có hoạt tính:•Exonuclease: thủy giải dần liên kết giữa các nucleotide từđầu phân tử DNA theo 2 chiều 5’ – 3’ và 3’ – 5’•Polymerase: tổng hợp theo chiều 5’ – 3’Klenow của DNA pol I•Có hoạt tính polymerase và exonuclease•Mất đi hoạt tính 5’ – 3’ không mong muốn IV. CÁC ENZYME THAM GIAEnzim t4 polynucleotid kinase: xúc tác sự chuyển nhómgama-phosphate của ATP cho đầu 5’ của DNA hay RNA. Cóhai kiểu phản ứng:•Nhóm gama- phosphate được chuyển đến đầu 5’ của mộtDNA đã mất nhóm phosphate•Khi có một lượng thừa ADP, DNA chuyển nhóm phosphatecho ADP và nhận nhóm gama- phosphateT4 DNA ligase: nối 2 trình tự DNA đầu bằngIV. CÁC ENZYME THAM GIAT7 RNA polymerase: có nguồn gốc từ phage xâm nhiễmE.coli, xúc tác sự tổng hợp RNA từ một mạch của một phântử DNA mạch đôi theo chiều 5’ – 3’.SP6 RNA polymerase: có nguồn gốc từ phage xâm nhiễmSalmonella Typhimurium, có chức năng giống với T7