Phương pháp định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản mô học

Mục đích nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng phương pháp đánh giá định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang tiêu bản mô da người trên cơ sở kỹ thuật số phân tích ảnh chụp tiêu bản.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phương pháp định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản mô họcTẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỨC ĐỘ PHẢN ỨNGMIỄN DỊCH HUỲNH QUANG TRÊN TIÊU BẢN MÔ HỌCTưởng Phi Vương*TÓM TẮTMục tiêu: xây dựng phương pháp đánh giá định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnhquang tiêu bản mô da người trên cơ sở kỹ thuật số phân tích ảnh chụp tiêu bản. Phương pháp:tính tỷ lệ diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang và tính cường độ sáng của từng ảnh thubằng phần mềm ImageJ. Sử dụng test Spearson để tính tỷ số tương quan r các cặp số liệu.Kết quả: cả hai phương pháp đánh giá định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quangđều thể hiện tính chính xác, đơn giản, dễ áp dụng, dễ phổ biến và thống nhất cao, sử dụngcông cụ phần mềm hoàn toàn miễn phí, cũng như cho phép xử lý số liệu nghiên cứu bằng cácthuật toán thống kê.* Từ khóa: Mô da; Miễn dịch huỳnh quang; Desmoglein-1.Quantitative-Analyzing Results of Immunofluoresence Stain onHistological SlideSummaryObjectives: To create and estimate effectiveness of quantitative methods for estimatingimmunofluorescence reactions based on digital analysis of skin tissue slide photo fromconfocal laser scanning microscopy. Methods: Immunofluorescence reactions on cryostatsectioned and paraffin-slide of human skin were carried out with anti- desmoglein-1 antibody.The total of all immunofluorescence positive areas and mean of grey level in the digital photowere calculated automatically by using ImageJ PC software. Spearson test was used to analyze thecorrelation of this result. Results: Both quantitative methods in evaluation of immunofluorescenceresults are simple and easy to use with high level of validation and free image processingsoftware. Beside, the immunofluorescence evaluation method based on photo grey level could helpinvestigators more choices when statistically analyzing results of immunofluorescence reactions.* Keywords: Immunofluorescence quantitative methods; Skin tissue; Desmoglein-1.ĐẶT VẤN ĐỀCùng với những thành tựu của khoahọc kỹ thuật trong lĩnh vực y tế, sự ra đờicủa kính hiển vi đồng tiêu quét laser nhậnđược sự quan tâm của các nhà nghiêncứu, là công cụ hỗ trợ đắc lực cho nghiêncứu mô bệnh học bằng phương pháp miễndịch huỳnh quang. Kết quả phản ứng miễndịch huỳnh quang được biểu hiện trên ảnhchụp tiêu bản bằng kính hiển vi đồng tiêuquét laser với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.* Viện 69, Bộ Tư Lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí MinhNgười phản hồi (Corresponding): Tưởng Phi Vương (tphivuong@yahoo.com)Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017Ngày bài báo được đăng: 30/08/201780TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017Tuy nhiên, việc đánh giá mức độ phản ứngmiễn dịch huỳnh quang trên những ảnh nàymới chỉ mang tính định tính (có - không,yếu - mạnh) và chưa thực sự khách quan.Điều này cho thấy cần phải xây dựngphương pháp đánh giá định lượng mứcđộ phản ứng miễn dịch huỳnh quang đểlàm tăng tính chính xác và khách quan,tin cậy của kết quả nghiên cứu. Phần mềmphân tích ảnh kỹ thuật số miễn phí chuyêndụng cho nghiên cứu y sinh ImageJ củaViện Y học Quốc gia Mỹ cho phép chúngtôi thực hiện ý tưởng nghiên cứu này.ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU1. Đối tượng nghiên cứu.Mẫu mô da người bình thường kíchthước 1 x 1 cm, cố định bằng dung dịchformaldehyd 4% trong 24 giờ ở nhiệt độphòng.2. Phương pháp nghiên cứu.* Chuẩn bị mẫu mô da:- Pha mẫu mô da thành hai phần, mộtphần để cắt lạnh và phần còn lại đúcparaphin.- Tiến hành cắt tiêu bản (cắt lạnh vàcắt từ block paraphin) dày 4 µm (12 tiêubản mỗi loại), gắn lên lam kính bằng dungdịch dán albumin pha glycerin.- Tiêu bản cắt từ block paraphin đượctẩy paraphin, sau đó bộc lộ kháng nguyênbằng lò vi sóng (trong đệm citrate 10 mM,pH = 6, điện áp lò vi sóng 600 W, thời gian30 phút).* Nhuộm miễn dịch huỳnh quang cảhai loại tiêu bản theo quy trình sau:- Rửa tiêu bản nhanh bằng đệm PBS.- Khử huỳnh quang không đặc hiệu bằngNaBH 4 0,01% trong đệm PBS, 3 lần,5 phút/lần.- Rửa tiêu bản bằng đệm PBS, 3 lần,2 phút/lần.- Bão hòa với huyết thanh dê 10% trongPBS (30 phút, nhiệt độ phòng).- Ủ với kháng thể trực tiếp (khángDesmoglein) đ pha lo ng 50 lần (60 phút,nhiệt độ phòng).- Rửa nhanh bằng BSA/PBS 0,1%, 3 lần,2 phút/lần.- Ủ với kháng thể gián tiếp gắn huỳnhquang (AF488) nồng độ 1:200 trong hộpkín, đậy bằng giấy bạc (60 phút, nhiệt độphòng).- Rửa nhanh bằng BSA/PBS 0,1%, 3 lần,2 phút/lần.- Rửa nhanh bằng PBS, 2 lần, 2 phút/lần.- Gắn glyxerol (glycerin: PBS = 9:1 theotỷ lệ thể tích).- Để khô 10 phút ở nhiệt độ phòng tronghộp kín tránh ánh áng.- Soi tiêu bản nhuộm miễn dịch huỳnhquang bằng kính LSM 700 (Carl Zeiss,Đức) với nguồn lade Ex.488 nm, cườngđộ 5%, master gain 600, độ phóng đại630 lần, pihole 56 µm. Chụp ảnh ở cùngmột chế độ: ảnh 8 bít, độ phân giải 512 x512 pixels tại vị trí vi trường có ph ...