Phương pháp giải trình tự gen

Giúp xác định vị trí của gen trên NST, cho phép kết luận về bản chất của gen. Có ý nghĩa trong việc tìm hiểu những chức năng cấu trúc của gen cũng như các dòng gen.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phương pháp giải trình tự gen BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM ĐỀ TÀI BÁO CÁO: LỚP: DHSH07LT SVTH: Nhóm 15 GVHD: Th.s Trần Hồng Bảo Quyên1. Nguyễn Thanh Diệu2. Trần Thị Tha La3. Nguyễn Thị Cẩm Nương4. Nguyễn Thị Phương5. Dương Chí Sơn6. Đinh Thị Yến Thi7. Trần Văn Thiết8. Trần Trung ThịnhNỘI DUNG 1. Khái niệm giải trình tự gen và ý nghĩa của GTTG 2. Phương pháp giải trình tự gen: 2.1 Phương pháp Maxam – Gilbert 2.2 Phương pháp Sanger 2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động3. So sánh phương pháp Maxam–Gilbert và Sanger 4. Ứng dụng1.1.Khái Niệm:Giải trình tự gen (DNA sequencing) làphương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotid trong phân tử DNA.1.2 Ý nghĩa Giúp xác định vị trí của gen trênNST, cho phép kết luận về bản chất của gen. Có ý nghĩa trong việc tìmhiểu những chức năng cấu trúc của gen cũng như các dòng gen. 2.1 Phương pháp Maxam - GibertNguyên lý: Thủy giải đặc trưng phân tử DNA cầnxác định trình tự bằng phương pháp hóa học. Các bước thực hiệnBước 1: 5’OH 3’ 5’OH 3’- Đánh dấu phóng xạ P32 ở P , ATP, 32 enzymeđầu 5’ của mạch khuôn. P32 DNA đánh dấu P32 90oC- Biến tính bằng nhiệt độ.- Điện di tách lấy một mạch Điện di phân tách các mạch đơnDNA làm mạch khuôn, dùng P32mạch khuôn này cho các xử Tách lấy mạch đơ nlý tiếp theo. 2.1 Phương pháp Maxam - GibertBước 2: Thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệuCó thể sử dụng 4 ống nghiệm để thực hiện các phảnứng hóa học đặc hiệu khác nhau, tạo các đoạn DNAcắt dài ngắn khác nhau. Ống 1 Hóa chất xử lý Vị trí cắt 1 Dimethyl sunrfat pH 8 G 2 Piperidine formate pH2 A và G 3 Hydrazine C và T 4 Hydrazine + Nacl 1,5M C2.1 Phương pháp Maxam - Gibert 2.1 Phương pháp Maxam - GibertBước 3: Lấy sản phẩm xử lý trongmỗi ống nghiệm đem chạy điện di,hiện hình phóng xạ và xác địnhkết quả.Ví dụ: Xử lý Dimethylsunfat ở ốngphản ứng 1, phản ứng cắt tại G.2.1 Phương pháp Maxam - Gibert32 P ATCG32 P ATCGCCAG Trình tự gen ban đ ầu32 P ATCGCCAGTTG32 P ATCGCCAGTTGTACCAG 32 P ATCSau khi xử lý bằng 32 P ATCGCCADMSO4 32 P ATCGCCAGTT 32 P ATCGCCAGTTGTACCA 2.1 Phương pháp Maxam - GibertBước 4: Tập hợp kết quả thu được ở tất cả cácống nghiệm, thu được các đoạn polynucleotid dàingắn hơn kém nhau 1 nucleotid, từ đó xác địnhđược trình tự của DNA mạch khuôn.2.2 Phương pháp SangerNguyên lý: Dựa vào sự tổng hợp mạch bổsung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt độngcủa enzyme DNA Polymerase. Với việc sửdụng thêm các dideoxynucleotid (ddNTP) vàcác deoxynucleotid thông thường.2.2 Phương pháp SangerViệc tổng hợp mạch bổ sung sẽ bị dừng lạido ddNTP không có khả năng hình thành liênkết phosphodieste .2.2 Phương pháp SangerVật liệu:- Primer( 20 nucleotides)- DNA polymerase- DNA template- dNTP và ddNTP- Vật liệu đánh dấu- Hệ thống điện di Các bước tiến hànhBước 1: Biến tính DNA khuônĐiện di trên gel polyacrylamid để thu các mạchđơn DNA, dùng DNA này để tiến hành cácbước xử lý tiếp theo.2.1 Phương pháp SangerBước 2: Chuẩn bị cho phản ứng tổng hợpDNALấy 4 ống Eppendorf, cho các thành phầncần thiết vào mỗi ống : mạch khuôn, mồi cóđánh dấu phóng xạ P32, enzyme DNApolymerase, dNTP, dung dịch đệm thíchhợp và thêm vào mỗi ống tương ứng mộtloại ddNTP nhất định.2.2 Phương pháp Sanger2.2 Phương pháp SangerBước 3 : Thực hiện các phản ứng tổng hợpDNABước 4: Điện di kết quả, so sánh kết quảcác chuỗi mạch đơn DNA được tổng hợpđể xác định trình tự của mạch khuôn.2.2 Phương pháp Sanger ddTTP2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự độngNguyên lý: Hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắcsử dụng ddNTP do Sanger và cộng sự phát minh. Mồi và dNTP được đánh dấu huỳnh quang. Mỗi loại dNTP được đánh dấu huỳnh quang khác nhau, biểu thị các màu sắc khác nhau. Máy thực hiện tổng hợp các mạch đơn DNA mới trên cả 2 mạch khuôn DNA, sử dụng phần mềm trên máy tính để xử lý kết quả ...