Protease tinh sạch từ tôm sú Penaeus Monodon và một số tính chất cơ bản

Nghiên cứu đã thực hiện tinh sạch protease từ gan tụy tôm sú và sử dụng để xác định một số tính chất cơ bản. Hệ protease tôm gồm ít nhất năm loại khác nhau, với ba loại chính quyết định hoạt tính của chúng có phân tử lượng từ 20.200 - 25.000 Da. Protease gan tụy tôm thuộc nhóm protease serine, trong đó các enzyme tựa trypsin đóng vai trò chủ đạo hoạt động.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Protease tinh sạch từ tôm sú Penaeus Monodon và một số tính chất cơ bản Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2015 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC PROTEASE TINH SẠCH TỪ TÔM SÚ Penaeus monodon VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT CƠ BẢN PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF PROTEASE FROM BLACK TIGER SHRIMP Penaeus monodon Nguyễn Lệ Hà1 Ngày nhận bài: 14/5/2014; Ngày phản biện thông qua: 18/8/2014; Ngày duyệt đăng: 10/6/2015 TÓM TẮT Nghiên cứu đã thực hiện tinh sạch protease từ gan tụy tôm sú và sử dụng để xác định một số tính chất cơ bản. Hệ protease tôm gồm ít nhất năm loại khác nhau, với ba loại chính quyết định hoạt tính của chúng có phân tử lượng từ 20.200 - 25.000 Da. Protease gan tụy tôm thuộc nhóm protease serine, trong đó các enzyme tựa trypsin đóng vai trò chủ đạo hoạt động. Từ khóa: Tôm sú, protease, enzyme tiêu hóa, trypsin, chymotrypsin ABSTRACT Proteases were purified from hepatopancreas of Black Tiger Shrimp Penaeus monodon. Protease fraction in shrimp consisted of at least five different proteases, three of them (with molecular weights from 20.200 - 25.00 Da) were mainly responsible for the fraction activity. Protease from shrimp Penaeus monodon belonged to serine proteases with trypsin-like responsible for the main activity. Key words: Black Tiger shrimp, protease, digestive enzyme, trypsin, chymotrypsin I. ĐẶT VẤN ĐỀ Protease là nhóm enzyme phổ biến trong nguyên liệu thủy sản, chịu trách nhiệm chính trong quá trình tự phân giải của các protein mô cơ sau khi động vật chết, chúng cũng đóng vai trò gián tiếp trong hiện tượng biến đen của tôm. Nhiều sản phẩm lên men truyền thống như nước mắm, cá ủ chua được sản xuất dựa trên hoạt động của hệ enzyme có sẵn trong nguyên liệu. Protease cũng đã được tách chiết hoặc tinh chế và sử dụng như phương tiện trợ giúp hiệu quả ở rất nhiều lĩnh vực sản xuất và ngày càng đóng vai trò quan trọng hơn trong công nghệ thực phẩm. Tiềm năng ứng dụng của protease là vô cùng to lớn, vì vậy, nhiều nhà nghiên cứu đã thực hiện tách chiết chúng từ các nguyên liệu khác nhau và xác định tính chất để ứng dụng vào thực tế sản xuất. Cho tới thời điểm hiện tại, chúng ta đã có khá nhiều thông tin về các 1 protease trong dạ dày, ruột và gan tụy của nhiều động vật thủy sản ở các vùng nước lạnh (Haard, 1994), tuy nhiên, thông tin về protease của các thủy sản nuôi trồng trên địa phận Việt nam vẫn còn rất ít. Nghiên cứu này hướng tới mục đích tinh sạch protease từ tôm sú nuôi ở biển Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh và xác định một số tính chất của chúng. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu: Tôm sú sống (cỡ 40-50 con/kg) được vận chuyển từ ao nuôi về phòng thí nghiệm trong bình sục khí, giết chết bằng cách trộn với đá lạnh sau đó tách nội tạng để riêng trong túi PE, bảo quản ở -20oC và lấy ra khi cần nghiên cứu, thời gian bảo quản không quá bốn tuần. Tinh sạch protease: Toàn bộ quá trình tách chiết và tinh sạch enzyme được thực hiện ở nhiệt độ 0-4oC. Nội tạng tôm được nghiền nhỏ và chiết rút TS. Nguyễn Lệ Hà: Trường Đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh 32 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2015 bằng Tris-HCl 0,05M pH7,5 theo tỉ lệ nguyên liệu: dung môi 1: 3(w/v) trong 60 phút sau đó ly tâm (6000 vòng/ph, 15 phút) thu dịch chiết, kết tủa dịch chiết với (NH4)2SO4 70% trong 70 phút rồi ly tâm (tương tự như trên) sau đó loại muối qua đêm bằng màng thẩm tích. Cặn thu được hòa tan trong đệm photphat pH7 rồi đem tách trên sắc ký lọc gel Bio-Gel P-100 sử dụng cột 50x1,5cm của Bio- Rad. Tốc độ dòng 0,14 ml/ phút, thu phân đoạn (2ml/phân đoạn). Xác định trọng lượng phân tử của protease: Dùng phương pháp điện di Zymogram trên điện di đứng Bio-Rad với gel gom 4%, gel phân tán 12% có bổ sung cơ chất casein 0,1% ở hiệu điện thế 110V, cường độ dòng điện 30A trong thời gian hai giờ. Xác định hàm lượng protein: Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford (Bradford, 1976) dùng albumin huyết thanh bò làm chất chuẩn. Xác định hoạt độ protease: thực hiện theo phương pháp Amano (Amano, 2002) dùng casein từ sữa (Merck) làm cơ chất. Một đơn vị hoạt độ protease (U) được định nghĩa là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100µg tyrosine trong 60 phút ở điều kiện nhiệt độ 37±0,5 oC. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ muối NaCl đến hoạt độ protease: được xác định bằng cách cho enzyme tác dụng với cơ chất casein ở các pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl quan tâm khi xác định hoạt độ. Độ bền nhiệt của protease: khảo sát bằng cách ủ enzyme ở nhiệt độ quan tâm 30 phút, sau đó đo hoạt tính còn lại bằng phương pháp Amano. Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ protease: nghiên cứu bằng cách bổ sung chất định thử với nồng độ 0,001M vào phản ứng xác định hoạt tính enzyme. Ảnh hưởng của một số chất ức chế đặc hiệu đến hoạt độ protease: xác định bằng cách ủ chất định thử với cùng thể tích enzyme sao cho đảm bảo đúng nồng độ thích hợp cần thiết, giữ ở 250C trong 15 phút (Garcia-Carreno, 1992), sau đó xác định hoạt tính protease còn lại. Quá trình tinh sạch protease tôm được tóm tắt trong bảng 1. Sắc ký lọc gel thực hiện trên protease tôm sú ghi nhận một đỉnh hoạt độ chủ yếu duy nhất (hình 1) không hề trùng lắp với đỉnh protein ở phía sau cho thấy hiệu quả cao của công đoạn tinh sạch: phần lớn protein có hoạt tính thấp được loại bỏ, nhờ vậy, protease thu nhận có hoạt tính riêng cao và độ tinh sạch tăng lên 16,27 lần. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Tinh sạch protease từ tôm sú Hình 1. Sắc ký đồ lọc gel tinh sạch chế phẩm enzyme CPE protease nội tạng tôm Bảng 1. Tóm tắt quá trình tinh sạch protease Tổng hàm lượng protein (mg) Tổng đơn vị hoạt độ protease (U) Hoạt độ riêng (U/mg protein) Hiệu suất (%) Độ tinh sạch (lần) Dịch chiết 655,78 16132,50 24,60 1,00 1,00 Chế phẩm enzyme 169,72 10025,86 59,07 62,15 2,40 9,75 3902,40 400,25 24,19 16,27 Bước tinh sạch Lọc gel 2. Trọng lượng phân tử của protease Điện di đồ protease tôm sú có năm vạch, với ba vạch rõ ràng ...