RPA - Kỹ thuật mới trong chẩn đoán bệnh hại cây trồng

Bài viết giới thiệu những thành tựu của kỹ thuật này và đánh giá tiềm năng ứng dụng trong quản lý dịch bệnh trên cây trồng tại Việt Nam.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
RPA - Kỹ thuật mới trong chẩn đoán bệnh hại cây trồngKH&CN nước ngoàiRPA - Kỹ thuật mớitrong chẩn đoán bệnh hại cây trồngChu Đức Hà1, Đoàn Thị Nhung2, Trần Thị Hoa Mỹ1, 2,Nguyễn Thị Minh Nguyệt1, Lê Tiến Dũng1Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam2Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam1Các bệnh trên cây trồng thường lây lan nhanh và khó phát hiện ở giai đoạn sớm, không chỉ gây khókhăn cho công tác sản xuất mà còn ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng nông sản. Vì vậy,thực tiễn sản xuất luôn đòi hỏi những công cụ chẩn đoán và phát hiện bệnh chính xác, nhanh nhạy.Gần đây, nhiều công cụ hiện đại nhằm xác định và chẩn đoán bệnh hại trên cây trồng đã ra đời vàđược ứng dụng vào thực tiễn, trong đó kỹ thuật RPA (recombinase polymerase amplification) khuếchđại acid nucleic đẳng nhiệt được đánh giá là có tiềm năng lớn trong chẩn đoán bệnh virus. Bài viếtgiới thiệu những thành tựu của kỹ thuật này và đánh giá tiềm năng ứng dụng trong quản lý dịch bệnhtrên cây trồng tại Việt Nam.Bệnh hại cây trồng là mộttrong những nguyên nhânchủ yếu gây sụt giảmnăng suất và chất lượngnông sản, đe dọa an ninh lương thựcvà việc xuất nhập khẩu mặt hàng này.Phần lớn bệnh hại cây trồng được xácđịnh chủ yếu do một số tác nhân visinh vật, có thể kể đến như vi khuẩn,nấm, tuyến trùng và đặc biệt là virus.Thông thường, các bệnh trên câytrồng thường lây lan nhanh, rất khóphát hiện ở giai đoạn sớm. Điều nàygây khó khăn trong công tác sản xuấtcũng như cản trở quá trình xuất, nhậpkhẩu. Vì vậy, thực tế sản xuất luôn đòihỏi sự chính xác và nhanh nhạy củacác công cụ chẩn đoán và phát hiệnbệnh.Cùng với sự phát triển của khoahọc và công nghệ, nhiều công cụhiện đại nhằm xác định và chẩnđoán bệnh được ra đời và ứng dụngvào thực tiễn. Trong số đó, nổi bậthơn cả là ELISA, PCR truyền thống,LAMP - những công cụ chẩn đoánphân tử phổ biến để phát hiện tácnhân gây bệnh ở thực vật. Gần đây,kỹ thuật RPA - bản chất là khuếchđại acid nucleic (bao gồm cả ADN vàARN) mục tiêu dựa vào hoạt tính củaenzyme recombinase và polymeraseđã được ứng dụng và đánh giá là cótiềm năng lớn trong nghiên cứu chẩnđoán bệnh virus [1]. Trong thực tế,RPA tỏ ra rất ưu việt so với các kỹthuật truyền thống nên đã được ápdụng rất rộng rãi trong chẩn đoánbệnh trên người [2-4], động vật [5, 6]và gần đây là trong nông nghiệp. Tuynhiên, các ứng dụng của RPA trongnông nghiệp vẫn chưa thực sự nổibật. Song song với đó, nỗ lực của cácnhà khoa học trong việc tối ưu hóaquá trình tách chiết acid nucleic cũngđược ghi nhận [7]. Dưới đây, chúng tôicung cấp những nguyên tắc căn bảncủa kỹ thuật RPA và kỹ thuật táchchiết acid nucleic dựa trên cellulose,từ đó tóm lược một số thành tựu bướcđầu của RPA trong chẩn đoán bệnhtrên cây trồng.Nguyên lý và ưu điểm của kỹ thuật RPAĐể trở thành một phương phápđược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực,được ghi nhận trong hàng trăm côngtrình khoa học quốc tế uy tín trênPubMed (gần 60 kết quả được côngbố trong năm 2015 và 2016), kỹ thuậtRPA đã phát huy tối đa những ưu thếvề tính đơn giản, tiết kiệm chi phí vàthời gian phản ứng rất ngắn. Để xácđịnh trình tự mục tiêu, RPA yêu cầu2 mồi oligonucleotide được thiết kếđơn giản (có thể cần thêm 1 probe)để phản ứng bắt cặp xảy ra. Đầu tiên,enzyme recombinase được sử dụngđể liên kết với mồi tạo thành phức hợpnucleoprotein recombinase. Phứchợp nucleoprotein này sẽ trượt và tìmkiếm trình tự tương đồng trên phântử ADN mạch kép để hình thành cấutrúc D-loop. Trong khi đó, một phântử protein bám sợi đơn ADN (single-Soá 8 naêm 201861KH&CN nước ngoàistranded ADN-binding protein, SSB)sẽ bám và ổn định mạch bổ sung.Cuối cùng, enzyme polymerase bắtđầu tổng hợp sản phẩm theo hướngtừ vị trí mồi bắt cặp đến đích (hình 1)[8].Bảng 1. So sánh kỹ thuật RPA với PCR thông thường và phương pháp LAMP.Kỹ thuậtPCRLAMPRPASố lượng mồi24-62Nhiệt độ phản ứngChu trình nhiệt60-65 C20-45 oCThời gian phản ứng20-180 phút ...