Sử dụng promoter mạnh Pgrac212 để tăng cường sự biểu hiện tiết amylase chỉ thị ở Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là mô hình nghiên cứu vi khuẩn gram (+) trong hơn 4 thập kỷ và được tổ chức FDA của Hoa Kỳ đánh giá là sinh vật an toàn GRAS (Generally Regarded as Safe). B. subtilis còn được sử dụng rộng rãi trong sản xuất protein công nghiệp với qui mô lớn bởi khả năng tiết protein hiệu quả ra môi trường nuôi cấy.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Sử dụng promoter mạnh Pgrac212 để tăng cường sự biểu hiện tiết amylase chỉ thị ở Bacillus subtilisTẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 90-96SỬ DỤNG PROMOTER MẠNH Pgrac212 ĐỂ TĂNG CƯỜNG SỰ BIỂU HIỆNTIẾT -AMYLASE CHỈ THỊ Ở Bacillus subtilisHuỳnh Kiều Thanh1,2, Phan Thị Phượng Trang1, Trần Linh Thước1, Nguyễn Đức Hoàng1*1Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG tp. Hồ Chí Minh, *ndhoang@hcmus.edu.vn2Công ty TNHH Công nghệ sinh học HT, tp. Hồ Chí MinhTÓM TẮT: Bacillus subtilis là mô hình nghiên cứu vi khuẩn gram (+) trong hơn 4 thập kỷ và được tổchức FDA của Hoa Kỳ đánh giá là sinh vật an toàn GRAS (Generally Regarded as Safe). B. subtilis cònđược sử dụng rộng rãi trong sản xuất protein công nghiệp với qui mô lớn bởi khả năng tiết protein hiệuquả ra môi trường nuôi cấy. Nhằm tăng khả năng sử dụng B. subtilis để biểu hiện protein tái tổ hợp, hệthống vector biểu hiện pHT có mang promoter mạnh Pgrac ra đời. Promoter này được xây dựng dựa trênpromoter mạnh phụ thuộc σA của operon groESL từ B. subtilis dung hợp với yếu tố điều hòa lac operator(lacO) từ Echerichia coli, cho phép điều hòa biểu hiện vượt mức protein nội bào lên đến 16% proteintổng. Gen amyQ mã hóa cho α-amylase (AmyQ) có nguồn gốc từ Bacillus amyloliquefasciens đã được sửdụng làm chỉ thị để tạo vector pHT43-amyQ mang promoter Pgrac (Pgrac-amyQ) và đã biểu hiện tươngđối tốt trong B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N. Trong nghiên cứu này, promoter Pgrac212 đượcchọn lọc từ thư viện với hơn 80 promoter cải biên từ promoter Pgrac để tạo plasmid pHT1200 (Pgrac212amyQ) nhằm khảo sát khả năng tăng cường sự biểu hiện tiết của protein chỉ thị AmyQ. Kết quả cho thấy,thiết kế Pgrac212-amyQ cho khả năng biểu hiện tiết α-amylase hiệu quả hơn Pgrac-amyQ ở cả hai chủngB. subtilis 1012-có biểu hiện protease ngoại bào và B. subtilis WB800N-mang đột biến bất hoạt támprotease ngoại bào. Nghiên cứu này chứng tỏ Pgrac212 là một promoter mạnh có tiềm năng ứng dụng đểbiểu hiện các protein tiết khác trong B. subtilis.Từ khóa: Bacillus subtilis, α-amylase, protease ngoại bào.MỞ ĐẦUB. subtilis được sử dụng rộng rãi trong côngnghiệp và nghiên cứu cơ bản vì (i) là vi khuẩnkhông gây bệnh và được tổ chức FDA của Mỹđánh giá là sinh vật an toàn GRAS (GenerallyRecognized As Safe); (ii) môi trường nuôi cấyđơn giản, rẻ tiền và có khả năng lên men ở mậtđộ cao [12]; (iii) bộ gen được giải trình tự hoànchỉnh và các gen thiết yếu đã được xác định [1].Bên cạnh đó, B. subtilis là vi khuẩn gram (+)cho phép tiết protein trực tiếp ra môi trườngnuôi cấy [12]. Tuy vậy, hiệu quả tiết proteinngoại lai chưa cao là một hạn chế cho việc sửdụng B. subtilis trong ứng dụng công nghiệp. Batrở ngại có thể kể đến là (i) sự nhận diện vàphân cắt protein ngoại lai của protease ngoạibào; (ii) sự bất ổn định của plasmid [9]; (iii)thiếu hệ thống biểu hiện hiệu quả [4]. Cácchủng đột biến mất protease được thiết kế đểgiảm tác động của protease ngoại bào lênprotein mục tiêu mà nổi bật là chủng B. subtilisWB800N đã bất hoạt tám protease ngoại bàođược sử dụng trong nghiên cứu này [3]. Bên90cạnh đó, sự ra đời của hệ thống vector pHT vớicơ chế sao chép theo kiểu θ (theta) đã khắc phụcsự không ổn định về mặt cấu trúc. VectorpHT01 mang promoter Pgrac được dung hợp từpromoter groESL có nguồn gốc từ B. subtilisvới lac operator (lacO) từ E. coli được điều hòacảm ứng bằng IPTG cho khả năng biểu hiệnprotein mục tiêu gấp 50 lần so với promoterPspac được thiết kế trước đó [8]. Năm 2007, haivector pHT43-mang trình tự tín hiệu tiết SamyQcủa α-amylase và pHT01-không mang trình tựtín hiệu tiết đã được thương mại và phân phốibởi Công ty CNSH MoBiTec (CHLB Đức).Gen amyQ mã hóa cho α-amylase (AmyQ)có nguồn gốc từ B. amyloliquefasciens được sửdụng phổ biến làm chỉ thị trong các nghiên cứubiểu hiện tiết vượt mức ở B. subtilis [2, 6].Trong một nghiên cứu trước đó, chúng tôi đãdùng AmyQ làm chỉ thị để khảo sát khả năng sửdụng vector pHT01 chứa promoter Pgrac trongchủng B. subtilis WB800N [11]. Trong bài báonày, amyQ được sử dụng làm chỉ thị để tạo cácplasmid mới nhằm chứng minh khả năng cảiHuynh Kieu Thanh et al.thiện mức độ biểu hiện tiết trong B. subtilis nhờpromoter Pgrac212 [7]. Pgrac212 là mộtpromoter cải biên từ promoter Pgrac nhờ cóthêm vùng làm bền mRNA. lacO của Pgracđóng vai trò kiểm soát sự biểu hiện đồng thời lànhân tố làm bền đầu 5’-stem-loop, việc thay đổimột số trình tự trên lacO để giảm năng lượng tựdo (∆G) và thêm vào 13 nucleotide (13 spacer)vào giữa vùng lac operator và RBS (ribosomebinding site) nhằm tăng độ bền của mRNAvàgiúp lượng mRNA đích được tạo ra trong tế bàoở mức cao [7]. Plasmid pHT1200 mang genamyQ và trình tự tín hiệu tiết SamyQ dung hợpvới promoter Pgrac212 được tạo thành để khảosát khả năng tăng cường biểu hiện tiết của αamylase chỉ thị ra môi trường nuôi cấy, so sánhvới pHT43-amyQ mang promoter Pgrac. Sựbiểu hiện của amyQ khi không cảm ứng và cócảm ứng bằng IPTG được thực hi ...