Tách dòng gen cystatin II phân lập từ một số mẫu ngô địa phương Việt Nam

Bài viết trình bày kết quả tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen cystatin II phân lập từ mRNA của bốn mẫu ngô địa phương (SL, LC1, LC2, LC3) và giống ngô lai CP888. Gen cystatin II phân lập ñược có kích thước 405 bp, mã hoá protein cystatin gồm 134 axit amin.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tách dòng gen cystatin II phân lập từ một số mẫu ngô địa phương Việt NamTách dòngTAPgen CystatinCHI SINHII phânHOClập2014,từ một36(1):số mẫu110-117ngôDOI:10.15625/0866-7160/v36n1.4527TÁCH DÒNG GEN CYSTATIN II PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪUNGÔ ĐỊA PHƯƠNG VIỆT NAMVì Thị Xuân Thủy1, Hồ Mạnh Tường2, Lê Văn Sơn2,Nguyễn Vũ Thanh Thanh3, Chu Hoàng Mậu3*12Trường Đại học Tây BắcViện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam3Đại học Thái Nguyên, *chuhoangmau@tnu.edu.vnTÓM TẮT: Cystatin là một dạng protein ức chế hoạt ñộng của cysteine proteinase và ñóng vai trònhư cơ chất ñể xâm nhập vào trung tâm hoạt ñộng của cysteine proteinase, vì vậy ngăn cản việc ñivào của cơ chất protein khác. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả tách dòng và xác ñịnhtrình tự nucleotide của gen cystatin II phân lập từ mRNA của bốn mẫu ngô ñịa phương (SL, LC1,LC2, LC3) và giống ngô lai CP888. Gen cystatin II phân lập ñược có kích thước 405 bp, mã hoáprotein cystatin gồm 134 axit amin. Kết quả so sánh trình tự amino acid của protein suy diễn củanăm mẫu ngô và cystatin (mã số D38130) trên Ngân hàng Gen quốc tế cho thấy có 22 axit aminkhác nhau, nhưng không có sự khác biệt trong vùng chức năng CY. Gen cystatin II ñược sử dụngñể phát triển vector chuyển gen nhằm mục ñích cải thiện khả năng chống mọt ở ngô.Từ khóa: Cây ngô, gen cystatin II, tách dòng gen, trình tự nucleotide.MỞ ĐẦUCây ngô (Zea mays L.) là một trong nămloại cây lương thực chính của thế giới. Hạt ngôchứa khá ñầy ñủ các chất dinh dưỡng cho ngườivà gia súc. Ở Việt Nam, ngô là cây lương thựcquan trọng thứ hai sau lúa gạo. Trong nhữngnăm gần ñây, sản xuất ngô ở Việt Nam tăngnhanh nhờ sự thúc ñẩy của ngành chăn nuôi vàcông nghiệp chế biến. Đặc biệt từ những năm1990 trở lại ñây, diện tích, năng suất và sảnlượng ngô tăng liên tục nhờ ñưa ngô lai vàotrồng trên diện tích rộng.Các giống ngô lai cho năng suất cao nhưnggiá thành, chất lượng bị giảm nhiều do hạt củacác giống ngô này rất dễ bị mọt xâm hại. Mọtngô (Sitophilus zeamais Motsch.) là loại ñathực, chúng có thể ăn ñược hầu hết các loại ngũcốc, trong ñó có ngô. Các biện pháp bảo quảnhạt giống ngô sau thu hoạch thường tốn thờigian, hiệu quả thấp và tổn thất sau thu hoạchvẫn rất lớn.Cystatin là protein ức chế hoạt ñộng củacysteine proteinase (cysteine proteinaseinhibitor - CPI), tìm thấy ở ñộng vật, thực vật vàvi sinh vật. Ở mọt, cysteine proteinase làenzyme tiêu hóa, nếu bị ức chế thì sự tiêu hóa110của mọt sẽ bị cản trở [2, 7]. Chính vì vậy, tiếpcận nghiên cứu nhằm tăng cường khả năng ứcchế cysteine proteinase ở mọt ngô bằng kỹ thuậtgen ñược quan tâm nghiên cứu.Các giống ngô ñịa phương miền núi phíaBắc của Việt Nam tuy có năng suất thấp,hạt nhỏ nhưng có khả năng kháng mọt cao,do ñó dễ bảo quản hơn so với các giống ngô lainăng suất cao ñang ñược trồng phổ biến.Vì vậy, nghiên cứu tạo giống ngô vừa có năngsuất cao vừa có khả năng kháng mọt là chiếnlược trong ngành chọn giống ngô bằng côngnghệ gen.Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kếtquả tách dòng và xác ñịnh trình tự nucleotidecủa gen cystatin II (cDNA) nhằm tạo nguyênliệu ñể thiết kế vector mang gen cystatin II phụcvụ tạo dòng ngô chuyển gen có khả năng khángmọt cao.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUSử dụng bốn mẫu ngô ñịa phương thu thậpở tỉnh Sơn La, Lào Cai và giống ngô lai CP888do Trung tâm giống cây trồng Sơn La cung cấp(bảng 1).Vi Thi Xuan Thuy et al.Bảng 1. Các mẫu/giống ngô sử dụng nghiên cứuSTT12345Ký hiệumẫuSLLC1LC2LC3CP888Địa ñiểm thu mẫuMai Sơn - Sơn LaSi Ma Cai - Lào CaiSi Ma Cai - Lào CaiSi Ma Cai - Lào CaiGiống ngô lai CP888RNA tổng số ñược tách chiết bằng TrizolReagent KIT; cDNA ñược tổng hợp theo quytrình Maxima® First Strand cDNA SynthesisKIT; gen cystatin ñược khuếch ñại bằng kỹthuật PCR với cặp mồi ñặc hiệu theo chu kỳnhiệt: 94oC/4 phút, lặp lại 30 chu kỳ, mỗi chukỳ: (94oC/45 giây - 58oC/30 giây-72oC/60 giây);72oC/10 phút. Sản phẩm PCR ñược kiểm trabằng ñiện di trên gel agarose 0,8%; tinh sạchsản phẩm PCR theo GeneJET PCR PurificationKIT và gắn vào vector tách dòng pBT rồi biếnnạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng sốcnhiệt (42oC trong 1 phút 30 giây). Vi khuẩnmang vector tái tổ hợp ñược chọn lọc trên môitrường LB ñặc bổ sung X-gal, IPTG, kháng sinhcarbenicilin và bằng colony-PCR với cặp mồiM13. Plasmid tái tổ hợp ñược thu nhận bằngcách tách chiết theo phương pháp tách dòngphân tử [5]. Trình tự gen cystatin ñược xác ñịnhbằng thiết bị giải trình tự gen tự ñộng ABIPrism 3130 - USA/Japan. Số liệu ñược xử lýbằng phần mềm BioEdit, DNAStar.tạo cDNA với mồi ngẫu nhiên (RandomHexamer Primer). Phản ứng PCR nhân bảnñoạn mã hóa của gen cystatin II với cặp mồi ñãthiết kế ZmCysF/ZmCysR, kết quả kiểm tra sảnphẩm PCR bằng ñiện di trên gel agarose cùngmarker 1 kb ñược thể hiện ở hình 1.Kết quả thu ñược ở hình 1 cho thấy, cả 5mẫu ngô ñều cho sản phẩm PCR với một băngDNA với kích thước ...