Tách dòng gen Shrunken 2 từ dòng ngô h14 và thiết kế vector chuyển gen pCAMBIA 1301-Ubi-Sh2

Trong bài viết này, chúng tôi trình bày các kết quả nghiên cứu tách dòng gen Sh2 từ dòng ngô H14 và thiết kế vector chuyển gen pCambia 1301-Ubi-Sh2 phục vụ cho chuyển gen tăng cường tổng hợp tinh bột ở cây ngô.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tách dòng gen Shrunken 2 từ dòng ngô h14 và thiết kế vector chuyển gen pCAMBIA 1301-Ubi-Sh2TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 122-128TÁCH DÒNG GEN SHRUNKEN 2 (Sh2) TỪ DÒNG NGÔ H14 VÀ THIẾTKẾ VECTOR CHUYỂN GEN pCAMBIA 1301-Ubi-Sh2Nguyễn Thị Thu, Lê Hoàng Đức, Nguyễn Đức Thành*Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *nguyenducthanh_pcg@ibt.ac.vnTÓM TẮT: Gen Shrunken 2 (Sh2) đã được chứng minh là gen mã hóa cho tiểu phần lớn của enzymeADP-glucose pyrophosphorylase nội nhũ, một enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp tinh bột ở nội nhũ.Đoạn gen này đã được nghiên cứu chuyển thành công vào cây ngô làm tăng hàm lượng tinh bột lên đángkể so với cây đối chứng không chuyển gen. Với mục tiêu tạo các dòng ngô có năng suất, chất lượng cao,chúng tôi tiến hành nghiên cứu, tách dòng gen Sh2 và thiết kế vector phục vụ việc chuyển gen Sh2 vàomột số dòng ngô trồng ở Việt Nam. Trong bài báo này chúng tôi giới thiệu một số kết quả thu được vềtách dòng gen Sh2 bằng PCR từ dòng ngô H14 và xây dựng vector chuyển gen mang gen Sh2. Trình tựgen Sh2 tách dòng được từ dòng ngô H14 có độ tương đồng cao (99%) so với gen Sh2 đã công bố trênNgân hàng Gen quốc tế (GenBank) có mã số NM_001127632.1. Gen Sh2 từ dòng ngô H14 sau đó đượcgắn thành công vào vector biểu hiện pCambia1301 cùng với promoter Ubiquitin (Ubi) để thiết kế vectorchuyển gen mang gen Sh2: pCambia 1301-Ubi-Sh2 phục vụ cho chuyển gen.Từ khóa: ADP-glucose pyrophosphorylase, dòng ngô H14, gen Shrunken 2, tách dòng gen, vector chuyểngen.MỞ ĐẦUViệc tăng năng suất cây trồng đặc biệt là cáccây lương thực như ngô, lúa, lúa mì v.v. đang làthách thức đối với các nhà chọn tạo giống câytrồng. Hiện nay có hai hướng chủ yếu để tăngnăng suất cây trồng, đó là cải tiến phương thứccanh tác và sử dụng giống mới dựa vào nỗ lựccủa các nhà khoa học và chọn giống. Cho đếnnay, các nhà khoa học thường nghiên cứu tạogiống mới theo các hướng như: nghiên cứu đadạng di truyền nguồn gen, di truyền phân tử cáctính trạng quan tâm, chọn lọc nhờ chỉ thị phântử và công nghệ gen. Cây ngô là cây trồng thuhạt nên tăng năng suất cây chủ yếu phụ thuộcvào các yếu tố như: chiều dài bắp, số lượng hạt,khối lượng của hạt. Để ứng dụng công nghệ genvào việc tăng năng suất cây ngô chúng ta cầnnghiên cứu các quá trình liên quan đến năngsuất như: quá trình quang hợp, quá trình tổnghợp tinh bột, hoạt động của các gen điều khiểnquá trình tổng hợp sinh khối. Nhiều nghiên cứuhóa sinh và phân tử đã làm sáng tỏ vai trò củacác enzyme trong quá trình tổng hợp tinh bột.Các nghiên cứu cho thấy, ADP-glucosepyrophosphorylase (AGPase) là enzyme đóngvai trò chìa khóa trong quá trình điều khiển tổnghợp tinh bột ở hạt ngũ cốc [1, 2, 3, 4, 5, 7, 10].Enzyme AGPase có cấu trúc tứ phân gồm 2 tiểu122phần nhỏ được mã hóa bởi gen Brittle 2 (Bt2) và2 tiểu phẩn lớn được mã hóa bởi gen Shrunken2 (Sh2). Chuyển gen Sh2 và Bt2 là một trongnhững hướng nghiên cứu nhằm tăng khả năngtổng hợp tinh bột, tăng năng suất cây trồng.Hiện nay ở Trung Quốc đã có công bố về việcchuyển thành công hai gen này vào cây ngô làmtăng khối lượng hạt ngô: khối lượng 100 hạttăng lên 15% so với các dòng không chuyển genvà hàm lượng tinh bột tăng đến 74% so với 65%ở cây không chuyển gen [6].Trong bài báo này, chúng tôi trình bày cáckết quả nghiên cứu tách dòng gen Sh2 từ dòngngô H14 và thiết kế vector chuyển gen pCambia1301-Ubi-Sh2 phục vụ cho chuyển gen tăngcường tổng hợp tinh bột ở cây ngô.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUVật liệuVật liệu để nghiên cứu tách dòng gen Sh2 làcác hạt (sau 10 ngày thụ phấn) của dòng ngôH14 do Viện Nghiên cứu ngô cung cấp. VectorpBT do phòng Công nghệ tế bào thực vật, ViệnCông nghệ sinh học cung cấp. Chủng vi khuẩnE. coli DH5α do hãng Invitrogen cung cấp.Đoạn gen Ubi được phân lập tại phòngDi truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinhNguyen Thị Thu, Le Hoang Duc, Nguyen Duc Thanhhọc và được công bố trên Genbank với mã sốJX947345.1. Vector pCambia 1301 do phòngDi truyền tế bào thực vật, Viện công nghệ sinhhọc cung cấp.Cặp mồi đặc hiệu để nhân gen Shrunken 2(Sh2) được thiết kế bằng phần mềm Primer 3 [8]dựa trên trình tự gen Sh2 đã được công bố trênGenbank với mã số NM_001127632.1 và đượcbổ sung thêm các vị trí cắt của enzyme giới hạnphục vụ cho nhận biết và gắn gen vào vectorbiểu hiện. Mồi xuôi ZmSh2F: 5’-GCGGATCCGATATGCAGTTTGCACTTGC-3’ có gắntrình tự điểm cắt của enzyme BamHI. Mồingược ZmSh2R: 5’-GCGAGCTCCTATATGACAGACCCATCG TTG-3’ có gắn trình tự điểmcắt của enzyme SacI. Đoạn mồi xuôi có chiềudài là 28 nucleotide tỷ lệ GC là 53,6% và nhiệtđộ nóng chảy là 64,4oC. Đoạn mồi ngược cóchiều dài là 30 nucleotide, tỷ lệ GC là 53,3% vànhiệt độ nóng chảy của mồi là 64,1oC. Cặp mồisẽ nhân được đoạn gen có chiều dài lý thuyết là1,5 kb tương đương với chiều dài của đoạn genSh2.Phương phápRNA tổng số được tách từ hạt ngô dòngH14 bằng phương pháp sử dụng Trizol. Sảnphẩm tách được điện di kiểm tra trên gel ...