Tạo nguyên liệu in vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch hoa xà

Trong bài viết này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu tạo nguyên liệu cây in vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes trên cơ sở dùng mô nguyên liệu in vitro đã tạo được hướng mục đích dài hạn là nuôi nhân quy mô lớn sinh khối rễ tơ bằng phương pháp công nghệ sinh học, góp phần đáp ứng nguồn nguyên liệu dùng chế biến sản phẩm sử dụng trong lĩnh vực y dược.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tạo nguyên liệu in vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch hoa xà TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169 TẠO NGUYÊN LIỆU IN VITRO VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) Bùi Đình Thạch*, Nguyễn Minh Hiếu, Phạm Thị Phương Uyên, Ngô Kế Sương, Nguyễn Hữu Hổ Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)thachden78@yahoo.com TÓM TẮT: Với mục tiêu nhân giống in vitro cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) từ đoạn thân tạo nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy in vitro và chuyển gen, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, thời gian khử trùng 20 phút, 10% dung dịch javel là điều kiện tối ưu cho tạo mẫu in vitro (41,29%), môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L BA và 0,1 mg/L IBA tạo được chồi tối ưu (4,67 chồi/mẫu) sau 4 tuần nuôi cấy, chồi in vitro phát triển thành cây tốt nhất ở môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/L IBA. Hai chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogen 11325 và 15834 được sử dụng trong công thức chuyển gen tạo rễ tơ, kết quả bước đầu đã chọn lọc 5 dòng rễ được cho là thể chuyển gen. Từ khóa: Agrobacterium rhizogen, Plumbago zeylanica, in vitro, nuôi cấy. MỞ ĐẦU Cây bạch hoa xà, có tên khoa học là Plumbago zeylanica L., thuộc họ Plumbaginaceae, là một cây dược liệu có nguồn gốc từ vùng Tây Bắc châu Á [2], được phân bố ở một số vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Úc, châu Á và châu Phi [19]. Theo y học cổ truyền, cây Bạch hoa xà được sử dụng điều trị một số bệnh về da như bị vết thương, chàm, bệnh ghẻ, bệnh phong [1]. Nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều bộ phận như rễ, lá và cành của cây được sử dụng như nguồn dược liệu. Rễ cây chứa một acrid crystalline gọi là plumbagin, một naphtoquinone màu vàng được sử dụng như dược chất ở Ấn Độ từ khoảng 750 năm trước công nguyên dùng kháng ký sinh, bổ tim, bảo vệ gan và bảo vệ thần kinh. Ngoài ra, nhiều hoạt chất khác nhau được ghi nhận trong rễ cây này, bao gồm phenolic acids, tannins, anthocyanin... có hoạt tính kháng khuẩn [13]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, plumbagin được chiết tách từ cây có khả năng kháng ung thư [12], kháng khuẩn [4, 5], kháng sốt rét [8], ức chế hoạt động phân chia tế bào [3], kháng đột biến, kháng côn trùng [8] và làm giảm cholesterol tổng số [12]. Cây bạch hoa xà sinh trưởng chậm trong điều kiện tự nhiên, các rễ của cây dùng để thu nhận plumbagin cần nhiều năm mới cho hàm lượng hoạt chất cao [7]. Ở Việt Nam, do chưa có qui hoạch tổng thể vùng trồng thu nguyên liệu, vì vậy, việc khai thác rễ tự nhiên dùng làm nguồn dược liệu chế biến sản phẩm tiêu tốn nhiều thời gian, làm cạn kiệt lượng cây phân bố ngoài tự nhiên. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu tạo nguyên liệu cây in vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes trên cơ sở dùng mô nguyên liệu in vitro đã tạo được hướng mục đích dài hạn là nuôi nhân quy mô lớn sinh khối rễ tơ bằng phương pháp công nghệ sinh học, góp phần đáp ứng nguồn nguyên liệu dùng chế biến sản phẩm sử sụng trong lĩnh vực y dược. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica) sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên ở tỉnh Phú Yên được lấy mẫu đọan thân để khử trùng; sử dụng 2 chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC (American Type Culture Collection) 15934 và ATCC 11325 [dạng hoang dại (wild type), đều chứa plasmid pRi mang các gen rol (root loci) như rolB và rolC trên vùng T-DNA] được cung cấp bởi Phòng Công nghệ gen, Viện Sinh học nhiệt đới. Phương pháp Khử trùng mẫu cấy 161 Bui Dinh Thach et al. Đoạn thân (dài khoảng 1,5 cm) chứa chồi ngủ được rửa dưới vòi nước máy trong 10-15 phút, sau đó tiến hành rửa sạch bề mặt bằng nước xà phòng loãng và rửa lại bằng nước cất vô trùng. Tiếp theo, mẫu được khử trùng bằng dung dịch javel thương mại nồng độ 10% (v/v) trong thời gian 20 phút. Mẫu được rửa lại bằng nước khử ion vô trùng, loại bỏ phần mô chết trắng và cấy mẫu lên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) [10] đặc. Khảo sát sự tăng sinh chồi nách Các đoạn thân mang chồi nách 4 tuần tuổi (chồi cao khoảng 0,5 cm) được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA 1,0-2,5 mg/L và IBA 0,1-0,5 mg/L. pH môi trường được điều chỉnh về 5,8 trước khi hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1atm trong thời gian 30 phút. Các mẫu được nuôi trong điều kiện chiếu sáng 10 h/ngày ở nhiệt độ 22 ± 2oC. Khảo sát phát triển cây Mẫu cấy dùng cho thí nghiệm là những chồi in vitro có chiều cao khoảng 1,5 cm, được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung IBA nồng độ 0,1-0,35 mg/L, pH 5,8; điều kiện khử trùng môi trường và điều kiện nuôi như trên. Khảo sát sự tạo rễ bất định Nghiên cứu này nhằm mục đích tạo nguồn nguyên liệu rễ bất định dùng nuôi cấy so sánh với rễ tơ. Đoạn thân (dài khoảng 1,5 cm) và lá cây in vitro (có cuống) được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA (0,1-1,5 mg/L) và IBA (0,1-1,5 mg/L). pH 5,8; điều kiện khử trùng môi trường và điều kiện nuôi như trên. Khảo sát khả năng t ...