Thí nghiệm đường cong sinh trưởng của tế bào thực vật

Nguyên liệu - Một dòng tế bào dịch huyền phù của thực vật sinh trưởng tốt. Phương thức sau đây dựa trên cơ sở nuôi cấy tế bào thuốc lá. Nếu chọn dòng tế bào khác thì cần thay đổi môi trường. - Hỗn hợp muối khoáng của Murashige-Skoog (1962) (Bảng 7.2), 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), KH2PO4, inositol, thiamine.HCl, và sucrose để pha chế môi trường.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thí nghiệm đường cong sinh trưởng của tế bào thực vật Thí nghiệm đường cong sinh trưởng của tế bào thực vật1. Nguyên liệu- Một dòng tế bào dịch huyền phù của thực vật sinh trưởng tốt. Phương thứcsau đây dựa trên cơ sở nuôi cấy tế bào thuốc lá. Nếu chọn dòng tế bào khácthì cần thay đổi môi trường.- Hỗn hợp muối khoáng của Murashige-Skoog (1962) (Bảng 7.2), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), KH2PO4, inositol, thiamine.HCl, vàsucrose để pha chế môi trường.- Hai bình tam giác 125 mL- Pipette loại miệng rộng vô trùng (10 mL)- Tủ nuôi tế bào thực vật kèm máy lắc- Cân hóa chất- Ly tâm- Eppendorf tube2. Phương thức tiến hành- Chuẩn bị môi trường muối khoáng của Murashige-Skoog, 0,2 mg/L 2,4-D,0,18 g/L KH2PO4, 0,1 g/L inositol, 1 mg/L thiamine.HCl và 30 g/L sucrose.Điều chỉnh pH tới 5,8 bằng KOH 1N và phân phối môi trường vào hai bìnhtam giác loại 125 mL, sao cho mỗi bình tam giác chứa 30 mL.- Đậy nắp bình tam giác và khử trùng ở 121oC trong 20 phút.- Cấy vào bình tam giác chứa 30 mL môi trường với 1,5 mL của dịch huyềnphù tế bào 7 ngày tuổi và đặt trong tủ nuôi tế bào thực vật có máy lắc và lắc150 vòng/phút, nhiệt độ nuôi 27oC, chiếu sáng 8 giờ/ngày ở cường độ 2.000lux.- Lấy 1,5 mL dịch nuôi cấy mỗi ngày đã được trộn kỹ và cho vào Eppendorftube để cân, ly tâm tube ở 9.000 vòng/phút trong 4-5 phút và loại thể nổi. Cânlại tube và tính toán phần trăm trọng lượng tế bào ẩm. Đặt tube trong tủ sấy ở70oC trong hai ngày và cân lại để tính toán trọng lượng khô.- Vẽ đồ thị sự thay đổi nồng độ tế bào khô và tươi (ẩm) theo thời gian.Thí nghiệm đường cong sinh trưởng của nấm menTrong thí nghiệm này, chủng nấm men sẽ được nuôi cấy trong bình tam giácthuỷ tinh, và sự thay đổi nồng độ tế bào sẽ được kiểm soát bằng cách dùng bakỹ thuật khác nhau: đếm dưới kính hiển vi, xác định khối lượng khô, độ đụccủa dịch huyền phù tế bào.1. Nguyên liệu- Một chủng nấm men bất kỳ sinh trưởng trong nuôi cấy dịch huyền phù.Chúng ta có thể thu chủng nấm men từ một phòng thí nghiệm vi sinh vậthoặc mua một chủng đặc biệt từ công ty.- Glucose, dịch chiết nấm men, NH4Cl, MgSO4, CaCl2 và chất chống tạo bọtđể pha môi trường.- Hai bình tam giác 125 mL- Pipette vô trùng- Đèn Bunsen- Nồi khử trùng- Tủ ấm- Hemocytometer- Ly tâm- Cân hóa chất- Máy quang phổ2. Phương thức tiến hành- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:Môi trường sinh trưởng đặc trưng của nấm men: - Glucose: 100g - Dịch chiết nấm men: 8,5g - NH4Cl : 1,32g - MgSO4 : 0,11g - CaCl2 : 0,06g - Chất chống tạo bọt: 0,2 ml - Nước bổ sung vừa đủ :1 L- Rót 50 mL/bình vào 2 bình tam giác loại 125 mL.- Nút bình tam giác bằng một trong số vật liệu sau: giấy nhôm, nút plasticchịu nhiệt, nắp inox, hoặc bông không thấm nước.- Khử trùng bình tam giác đựng môi trường ở 121oC trong 20 phút.- Tiếp mẫu (inoculate) 1 mL dịch nuôi cấy nấm men trước đó vào bình tamgiác chứa môi trường vô trùng. Tiến hành cẩn thận để khỏi bị nhiễm bẩnpipette, nắp đậy và bình tam giác trong suốt quá trình tiếp mẫu. Để giảmthiểu cơ hội nhiễm bẩn, nên đốt nắp đậy và cổ của bình tam giác sau khi lấynắp ra để cấy nấm men vào.- Đặt bình tam giác vào trong tủ ấm ở 37oC.- Lấy 2 mL mẫu ở các khoảng thời gian khác nhau trong quá trình nuôi cấyđể xác định nồng độ tế bào bằng cách đếm trên kính hiển vi, xác định trọnglượng khô và đo độ đục (mật độ quang) bằng máy quang phổ. Thời gian lấymẫu phải được sắp xếp sao có thể thu được cho đường cong sinh trưởng tốtthể hiện cả ba phase sinh trưởng. Trước khi lấy mẫu phải trộn tất cả các thànhphần trong bình tam giác bằng cách lắc.