THIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI TRONG PHẢN ỨNG PCR BẰNG FASTPCR VÀ DNA CLUB

Mục tiêu của bài học: Thiết kế được những trình tự primer cho những trình tự DNA khuôn (vi sinh vật, virus và các động vật khác); phân tích được những thông số của primer qua các phần mềm.PCR là một kỹ thuật duy nhất để khuếch đại một mẫu DNA mong muốn khuếch đại( ví dụ những đoạn gene của vi sinh vật, vi khuẩn hay những đoạn gene của người và những động vật khác).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
THIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI TRONG PHẢN ỨNG PCR BẰNG FASTPCR VÀ DNA CLUBTHIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI TRONG PHẢN ỨNG PCR BẰNG FASTPCR VÀ DNA CLUBMục tiêu của bài học Thiết kế được những trình tự primer cho những trình tự DNA khuôn (vi sinh vật, virus và các động vật khác) Phân tích được những thông số của primer qua các phần mềm 2 Tì kimrnhựi họ m ế tì t snh cQuá trình sao chép DNA trong tế bào 3 Gi it ệ mô họ ớ hiu n cQui trình phản ứng PCR Thu nhận mẫu Các vi sinh vật, động vật Kỹ thuật PCR lần đầu tiên được Mullis và cộng sự mô tả vào năm 1986 và cũng do chính phát minh này Mullis đã được trao giải nobel vào năm 1993 4 Gi it ệ mô họ ớ hiu n cThành phần trong phản ứng PCR Phản ứng PCR được thực hiện khi có:  DNA mẫu  Primers (mồi xuôi và ngược dài khoảng 18-30 bp không bắt cặp bổ sung )  Taq polymerase ( emzyme chịu nhiệt tách từ vi khuẩn suối mước nóng Thermus aquaticus )  4 loại deoxiribomucleotid triphọtphat (dATP , dCTP, dTTP , dGTP) ,  Dung dịch đệm và Mg2+ 5 Gi it ệ mô họ ớ hiu n cMÁY PCRPCR là một kỹ thuật duy nhất đểkhuếch đại một mẫu DNA mongmuốn khuếch đại (ví dụ những đoạngene của vi sinh vật, vi khuẩn haynhững đoạn gene của người vànhững động vật khác) 6 Gi it ệ mô họ ớ hiu n cNguyên tắc trong phản ứng PCR Biến tính Bắt cặp Kéo dài 7 Gi it ệ mô họ ớ hiu n cNguyên tắc trong phản ứng PCR Phản ứng PCR gồm có 3 giai đoạn: • Biến tính DNA mẫu T=940C • Bắt cặp mồi Tm = 550C-650C • Giai đoạn kéo dài, tổng hợp DNA mới T kéo dài =700C 8 Gi it ệ mô họ ớ hiu n cMục đích, nguyên tắc Mồi là những đoạn nucleotide ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu 5 hay đầu 3 của mạch DNA khuôn mẫu. Mồi được thiết kế dựa vào 2 vùng trình tự đã được biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần khuếch đại. Forward primer Reverse primer Đoạn DNA cần khuếch đại 9 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c Primer là gì? Primer là một đoạn ngắn oligonucleotide nó là khả năng bắt cặp bổ sung với DNA khuôn Primer sẽ bắt cặp với đoạn DNA khuôn (DNA mục tiêu) cần khuếch đại số lượng lớn DNA 10 Tì kimrnhựi họ m ế tì t snh cĐặc tính của primer1. Tính chuyên biệt2. Tính ổn định nhiệt độ của phản ứng3. Tính tương thích cặp primer 11 Gi it ệ mô họ ớ hiu n cTính chuyên biệt Chỉ có duy nhất một vị trí bắt cặp của primer trên khuôn DNA. Template DNA 5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3 ’ CAGTCAACTGCTAC GTTGAACGTA GTTGAACGTA Primer càng dài thì nó càng thể hiện tính duy nhất và nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ bắt cặp càng cao. Để đảm bảo tính duy nhất chiều dài của primer 17-28 base. Thành phần (G+C) trung bình khoảng từ 50-60% sẽ cho ta nhiệt độ lai Gi it ệ mô họ ớ hiu n c 12Tính chuyên biệtTỷ lệ G/C trung bình khoảng từ 50-60% sẽ cho ta nhiệtđộ lai thích hợp 13 Gi it ệ mô họ ớ hiu n cNhiệt độ của primer 1. Nhiệt độ nóng chảy: Tmealt: Nhiệt độ nóng chảy là nhiệt độ của mồi khi chưa bắt cặp với DNA khuôn Tmprimer=59.9+0.41*(%GC)-600/(chiều dài nucleotide) khi mồi chưa bắt cặp với DNA, thường nhiệt độ nóng chảy từ 55-650C. 2. Nhiệt độ bắt cặp: Tanneal:Là nhiệ ...