Thiết kế vector chuyển gen kháng virus mang gen chọn lọc thân thiện với môi trường

Trong bài viết này, một vector chuyển gen kháng virus TMV theo cơ chế RNAi đã được thiết kế mang gen chọn lọc Man. Cấu trúc này đã được thử nghiệm chuyển vào cây thuốc lá, cây công nghiệp mẫn cảm với virus TMV, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của thuốc lá. Các dòng thuốc lá chuyển gen thu được trên môi trường chọn lọc Man đã được phân tích khả năng kháng virus TMV nhân tạo.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thiết kế vector chuyển gen kháng virus mang gen chọn lọc thân thiện với môi trườngTẠPCHÍSINHHỌC2013,35(3se):188194 THIẾTKẾVECTORCHUYỂNGENKHÁNGVIRUS MANGGENCHỌNLỌCTHÂNTHIỆNVỚIMÔITRƯỜNG LêThịThủy2,NguyễnThịThuHiền1,PhạmThịVân1,LêVănSơn1* 1 ViệnCôngnghệsinhhọc,ViệnHànlâmKH&CNViệtNam,*leson_03@yahoo.com 2 TrườngĐạihọcSưphạmHàNội TÓMTẮT:Việctạođượcmộtvectorchuyểngenthựcvậtmanggenchọnlọctíchcựcnhằmtạora nhữngcâytrồngbiếnđổigenthânthiệnvớimôitrườngsẽ gópphầnthúcđẩyviệcthươngmạihóa sảnphẩmchuyểngen.Trongnghiêncứunày,mộtvectorchuyểngennhị thể,pK7M/TMVCPichứa cấutrúcRNAiTMVCPivàgenmanAđãđượcthiếtkế.CấutrúcRNAiTMVCPilàmộtcátsétmang genchuyểnlặplạiđảochiềuđọạngenmãhóaproteinvỏ(coatprotein,CP)củavirusTMV(Tobacco mosaicvirus)nhằmlàmbấthoạt genCPcủaTMVtrongcáccâychuyểngenkhángvirusnày.Gen manAmãhóachoenzymephosphomannoseisomerase(PMI)làmộtmarkerchọnlọctíchcựcchophép sửdụngmannoselàmchấtchọnlọc.Đểkiểmtrahiệuquảcủavectorthiếtkế,cấutrúcRNAiTMV CPivàgenmanAtrongvectornàyđãđượcchuyểnvàohaigiốngthuốcláNicotianatabacumK326và C91 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sử dụng hệ thống chọn lọc bằng đường mannose,40dòngthuốcláchuyểngenthế hệ T0củacả haigiốngpháttriểnbìnhthườngtrênmôi trườngchọnlọcđãđượcphântíchbằnglâynhiễmnhântạovirusvàPCR.Kếtquảchothấy,có64,3% (18/28)dòngthuốcláchuyểngenK326và58,3%(7/12)dòngthuốcláchuyểngenC91cóbiểuhiện khángvirusTMVhoàntoànvàdươngtínhvớiPCRgenchuyển. Từkhóa:Nicotianatabacum,RNAi,manA,chọnlọctíchcực,khảmthuốclá,TMV.MỞĐẦU dưỡngcủatế bào. Vìthế cáctế bàochuyển gen sẽ phát triển được trên môi trường có Việc thay thế các gen chọn lọc gây nên đường Man thay vì sacrose trong điều kiệnnhữnglolắngvềđộantoànvớisứckhỏecon bìnhthường.Đốivớicáctếbàokhôngchuyểnngười và môi trường như các gen kháng lại gen, bản thân đường Man không gây độc,kháng sinh hygromycin (hpt) và kanamycin nhưng khi bị phốt pho hóa bởi hexokinase(nptII) hoặc kháng lại các chất diệt cỏ như thành mannose6phosphate dẫn đến các tếphosphinothricin (bar) và chlorosulfuron (als) bàokhôngthểpháttriểnđược.bằngthế hệ cácgenchọnlọctíchcực,thânthiệnvớimôitrườngđanglàvấnđềđượcquan RNAilàcơ chế tự nhiêncủatế bàosốngtâmtrongcácnghiêncứuchuyểngenvàothực cóthểlàmbấthoạtmộtgennàođó.Bằngsựvật. pháttriểncủacôngnghệsinhhọc,cơchếcủa quátrìnhnàyđãđượclàmsángtỏ.Chođến Gen manA mã hóa cho enzyme nay,RNAiđượcpháttriểnthànhkỹthuậthiện phosphomannose isomerase (PMI) có nguồn đạivàhữuhiệutrongviệcchốnglạicácbệnhgốctừ Escherichiacoli[5]làmộttrongnhững dovirusgâyraởthựcvật[8].genchọnlọctíchcựcđượcchuyểnthànhcôngởmộtsốloạithựcvậtnhư:củcảiđường[4], Trongbàibáonày,mộtvectorchuyểngen ngô [11,12],lúamì [12],Arabidopsis [9],cà khángvirusTMVtheocơ chế RNAiđãđượcchua[7],đủđủ[13],hànhtây[1]vàdưachuột thiếtkếmanggenchọnlọcMan.Cấutrúcnày[2].Tếbàothựcvậtmanggennàythìtrênmôi đãđượcthửnghiệmchuyểnvàocâythuốclá,trường có bổ sung mannose (Man), PMI sẽ câycôngnghiệpmẫncảmvớivirusTMV,làmbiếnđổimannose6phosphatethànhfructose ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và6phosphate cóthể sử dụngnhư làchấtdinh chất lượng của thuốc lá. Các dòng thuốc lá188 TẠPCHÍSINHHỌC2013,35(3se):188194c ...