Thiết lập quy trình PCR-RFLP xác định kiểu gen vi rút BK phân lập từ bệnh nhân ghép thận

Bài viết Thiết lập quy trình PCR-RFLP xác định kiểu gen vi rút BK phân lập từ bệnh nhân ghép thận được nghiên cứu với mục tiêu thiết lập được quy trình PCR- RFLP xác định kiểu gen của các chủng BKV phân lập từ bệnh nhân ghép thận.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thiết lập quy trình PCR-RFLP xác định kiểu gen vi rút BK phân lập từ bệnh nhân ghép thậnNghiên cứu khoa học công nghệTHIẾT LẬP QUY TRÌNH PCR-RFLP XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VI RÚT BK PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN GHÉP THẬN ĐINH THỊ THU HẰNG (1), NGUYỄN THU TRANG (1, 2), HOÀNG XUÂN SỬ (1) 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ghép thận được công nhận là một tiến bộ đáng kể của y học hiện đại và đượcxem là phương pháp điều trị thay thế hiệu quả cho những bệnh nhân suy thận mạntính giai đoạn cuối. Điều này sẽ mang lại kết quả điều trị tích cực và kinh tế nhấtcũng như sự cải thiện về chất lượng sống cho bệnh nhân so với chạy thận nhân tạo.Việc theo dõi điều trị bệnh nhân sau ghép thận đóng vai trò rất quan trọng trong duytrì chức năng thận ghép, giảm thiểu tối đa nguy cơ mất mô ghép hay suy chức năngthận ghép [1]. BK polyomavirus (BKV) là vi rút cơ hội phổ biến trong cộng đồng, lây nhiễmcho trẻ em thời thơ ấu qua đường hô hấp hoặc phân-miệng, có khả năng gây bệnh íthoặc không triệu chứng và tồn tại ở trạng thái tiềm ẩn. Ở bệnh nhân ghép thận, việcsử dụng thuốc ức chế miễn dịch kéo dài là điều kiện thuận lợi cho BKV có thể dễdàng tái hoạt động dẫn đến rối loạn chức năng thận ghép, có thể khiến cơ thể khôngnhận cấy ghép [1]. BKV có kích thước nhỏ, xấp xỉ 40-45 nm, dạng hình tròn hoặchình cầu, không có vỏ ngoài được bao bởi caspid hình nhị thập diện gồm 72capsomer pentameric [2]. Cấu trúc BKV bao gồm ba protein caspid VP1, VP2, VP3,và hệ gen là phân tử DNA sợi kép dạng vòng khép kín liên kết với các histon [3]. Hệgen BKV-DNA có kích thước khoảng 5,1 kb, được phiên mã hai chiều, về mặt chứcnăng được chia thành ba vùng: kiểm soát sớm, kiểm soát muộn và kiểm soát khôngmã hóa. Trong đó, vùng kiểm soát muộn được tập trung nhiều trong nghiên cứuphân tử vi rút, đây là vùng mã hóa ba protein cấu trúc là capsid với VP1 là proteincấu trúc chính, chiếm xấp xỉ 80% toàn bộ protein vỏ. Sự đa đạng di truyền trong genmã hóa protein VP1 cũng là căn cứ để phân loại các kiểu gen của BKV. BKV có bốnkiểu gen chính: I, II, III, IV, trong đó kiểu gen I là phổ biến nhất với tỷ lệ 80% vàkiểu gen IV khoảng 15% [4]. Hai kiểu gen còn lại là II và III hiếm gặp hơn, đượccông bố ở một số quốc gia trên thế giới như Anh, Nhật Bản. Việc xác định kiểu gen BKV giúp cung cấp những đặc điểm di truyền phân tửBKV có giá trị trong việc phát hiện nguồn gốc phát sinh, góp phần giám sát BKV,dự báo mối liên quan tiềm tàng giữa diễn biến gây bệnh của BKV và tiến triển củaBKVN (BKV-associated Nephropathy, bệnh thận do BKV) ở bệnh nhân ghép thận.Hiện nay, việc xác định kiểu gen thường được thực hiện thông qua giải trình tự vàxây dựng cây chủng loại phát sinh. Tuy nhiên vẫn cần thiết phải xây dựng quy trìnhxác định kiểu gen tối ưu khi rút ngắn thời gian với giá thành cạnh tranh mà vẫn bảođảm độ tin cậy, độ chính xác cao. Vì vậy, chúng tôi thực hiên công trình này vớimục tiêu thiết lập được quy trình PCR- RFLP xác định kiểu gen của các chủng BKVphân lập từ bệnh nhân ghép thận.Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 27, 12 - 2022 41 Nghiên cứu khoa học công nghệ 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu Mẫu bệnh phẩm gồm 30 mẫu nước tiểu dương tính BKV-DNA từ bệnh nhânđang theo dõi điều trị sau ghép thận tại Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân yđược xét nghiệm định lượng BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR theo quy trìnhcủa Học viện Quân y với vùng gen đích VP1 [12]. Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp thực nghiệm mô tả và phân tíchtrong phòng thí nghiệm, sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, với các thiết bị thuộcPhòng Vi sinh và các mầm bệnh sinh học, Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự,Học viện Quân y. 2.2. PCR khuếch đại và tinh sạch sản phẩm PCR của đoạn gen VP1 Mẫu nước tiểu thu thập trong ống falcon 50, ly tâm 3200 vòng/ phút trong 30phút, thu cặn được sử dụng để tách chiết DNA tổng số theo quy trình bộ kitGeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit. Vùng gen VP1 củaBKV được khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi BK_(S+AS) có trình tự BK_S: 5’-ATCAAAGAACTGCTCCTCAAT-3’ và BK_AS: 5’-GCACTCCCTGCATTTCCAAGGG -3’ tương ứng với vị trí nucleotide 1361-1381và 1919-1940 (chủng Dunlop, mã số: V01108.1) cho sản phẩm có kích thước theotính toán lý thuyết là 580 bp. Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 1X GoTaqMaster Mix (Promega- Mỹ); 0,1 μM mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại, 5 μl DNAkhuôn, nước khử ion vừa đủ thể tích 25 μl. Quá trình khuếch đại được thực hiện trênmáy PCR Eppendorf Mastercycler proS (Đức) với chu trình: (95o C/7 phút, (95oC/45 giây; 58oC/ 45 giây; 72oC/ 45 giây)x40, (72º trong 7 phút). Các sản phẩm PCR đúng kích thước theo tính toán lý thuyết được tinh sạch sửdụng bộ GeneJET PCR Purification Kit hoặc GeneJET Gel Extraction Kit. Sảnphẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel a ...