THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÂY TRỒNG

Chuyển gen bar kháng thuốc diệt cỏ glufosinate trên cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens- Các giống đậu xanh được sử dụng trong thí nghiệm là giống TN 182 của Công ty TNHH-TM Trang Nông, giống HL 89-E3 của Công ty cổ phần giống cây trồng Nha Hố.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÂY TRỒNG 1 I H C NÔNG LÂM TP. H CHÍ MINH VI N CÔNG NGH SINH H C & MÔI TRƯ NG TH C HÀNHCÔNG NGH SINH H C CÂY TR NG THÁNG 12/2007 Lưu hành n i b 2 N I DUNG TH C HÀNHChuy n gen bar kháng thu c di t c glufosinate trên cây u xanh (Vignaradiata (L.) Wilczek) b ng vi khu n Agrobacterium tumefaciens- Các gi ng u xanh ư c s d ng trong thí nghi m là gi ng TN 182 c a Công tyTNHH-TM Trang Nông, gi ng HL 89-E3 c a Công ty c ph n gi ng cây tr ng NhaH.- Vi khu n Agrobacterium tumefaciens ch ng EHA101pIB-GUS do Hans-JörgJacobsen thi t k , mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc, plasmid này mang gengusA, gen nptII và gen bar v i promoter là CaMV 35S và terminator là nos poly–A. Hình 1. Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 3 PH N 1. KH TRÙNG H T, CHU N B MÔI TRƯ NGI. V t l i u a. Kh trùng h t - M u h t. - D ng c c y mô: pince, dao c y, èn c n. Hóa ch t kh trùng: C n 70o, c n 96 o, Javel, kháng sinh Tetracilin. - - Nư c c t ti t trùng b. Chu n b môi trư ng * Môi trư ng ti n nuôi c y (pre-culture medium): t o i u ki n cho môthích nghi v i môi trư ng nuôi c y. * Môi trư ng (inoculation medium): môi trư ng t o i u ki n cho vikhu n xâm nh p vào mô th c v t. * Môi trư ng ng nuôi c y (co-culture medium): môi trư ng thu n l i cho sphát tri n c a mô và vi khu n.II. Cách ti n hành a. Kh trùng h t theo quy trình sau ây - R a h t b ng nư c ti t trùng 3 l n (m i l n 5 phút). - R a h t b ng c n 960 3 l n, (m i l n 5 phút). - R a b ng nư c ti t trùng 1 l n. - R a b ng nư c javel m c 3 l n, (m i l n 10 phút). - R a b ng nư c c t ti t trùng 1 l n. - R a h t b ng kháng sinh 500mg/l Tetraciclin trong 5 phút. - R a b ng nư c ti t trùng 1 l n. - Ngâm h t b ng nư c ti t trùng trong 1 gi . - Ngâm h t qua êm. b. Chu n b môi trư ng • Môi trư ng ti n nuôi c y (pre-culture medium) Môi trư ng B5 (l ng) + 1 mg/l BA Thành ph n môi trư ng B5 Thành ph n N ng (g/l) 4 KNO3 25 (NH4)2SO4 1.34 CaCl2.2H2O 1.5 MgSO4.7H2O 2.5 NaH2PO4.H2O 1.5 MnSO4*H2O 1 H3BO3 0.3 ZnSO4*7H2O 0.2 NaMoO4*2H2O 0.025 CuSO4*5H2O 0.0025 CoCl2*6H2O 0.0025* Môi trư ng (inoculation medium): B5, 20g/l glucose, 2 g/l MES, pH 5.5 -5.6.* Môi trư ng ng nuôi c y (co-culture medium) - B5 - 2 g/l MES (Morpholino – ethan – sulfonic acid) - 0.5 g/l KNO3 - 0.87 g/l CaCl2 - 0.5 g/l MgCl2 * 7H2O - 0.8 g/l glutamine - 10 mg/l gluthatione - 2.2 mg/l TDZ (Thidiazuron) - 10 g/l sucrose - 10 g/l glucose - 4 g/l agar - pH 5.2 - Acetosyringone (0; 50; 100 µM) (b sung sau khi h p kh trùng) 5 PH N 2. GIEO H TI. V t l i u - H t ã kh trùng và ngâm qua êm. - D ng c nuôi c y mô: pince, dao c y, èn c n, … - ĩa petri (h p nh a) ch a môi trư ng agar.II. Cách ti n hành Lo i b l p v ngoài (seed coat) c a h t u xanh và t h t vào môi trư ngagar (10 g/l). Hình 2. Hình thái c a th c v t 1 lá m m và 2 lá m m 6 PH N 3. TÁCH TR DƯ I LÁ M M (hypocotyl) và TĂNG SINH VI KHU NI. V t l i u - H t gi ng ã n y m n. - D ng c nuôi c y mô: pince, dao c y, èn c n, … - ĩa petri (h p nh a) ch a môi trư ng agar. - ĩa petri ch a môi trư ng ti n nuôi c y. - Fancol 15ml. - Môi trư ng LB.II. Cách ti n hành C t tr dư i lá m m t i i m m t lá m m (cotyledonary node) b ng cách lo i btr trên lá m m (epicotyl) và r m m (radicle). Sau ó t các tr dư i lá m m (kíchthư c trung bình 0,5 – 0,6 cm) trong ĩa petri ch a môi trư ng ti n nuôi c y (pre-culture medium) trong i u ki n chi u sáng. Nhân sinh kh i vi khu n Agrobacterium tumefaciens trong môi trư ng LB trên ...