Thực hành nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật(ghi chú: + rất cần, - tùy theo nhu cầu)1. Phòng rửa và cất nướcMáy cất nước 1 lần (8 L/giờ) Máy cất nước 2 lần (4 L/giờ) Máy sản xuất nước khử ion2. Phòng sấy hấpTủ sấy 60-300oC Nồi khử trùng (autoclave) loại nhỏ (25 L)Nồi khử trùng loại lớn (50-100 L)
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thực hành nuôi cấy mô và tế bào thực vật 150 THỰC HÀNHNUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT 151 MỤC LỤCBài 1 Mở đầu ................................ .............................. 153I. Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bàothực vật ................................ ................................ .......... 153II. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô-tếbào thực vật ................................ ................................ ... 156Bài 2 Môi trường dinh dưỡng ................................ ..... 172I. Thành phần chính của môi trường .............................. 174II. Vấn đề lựa chọn môi trường................................ ...... 182III. Chuẩn bị các dung dịch làm việc ............................. 184Bài 3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ................................ . 194I. Mục đích và yêu cầu................................ ................... 194II. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất ................................ ..... 195III. Phương pháp tiến hành ................................ ............ 197Bài 4 Nuôi cấy đơn bội in vitro ................................ .... 204I. Mục đích và yêu cầu................................ ................... 204II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất................................ ......... 206III. Phương pháp tiến hành ................................ ............ 207 152Bài 5 Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù ........................ 213I. Mục đích và yêu cầu................................ ................... 213II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất................................ ......... 215III Phương pháp tiến hành ................................ ............. 217Bài 6 Nuôi cấy protoplast ................................ ............ 222I. Mục đích và yêu cầu................................ ................... 222II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất................................ ......... 223III. Phương pháp tiến hành ................................ ............ 225Bài 7 Chuyển gen thông qua Agrobacteriumtumefaciens ................................ ................................ ... 231I. Mục đích và yêu cầu................................ ................... 231II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất................................ ......... 232III. Phương pháp tiến hành ................................ ............ 234TÀI LIỆU ĐỌC THÊM ................................ .............. 242 153Bài 1 Mở đầuI. Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tếbào thực vật(ghi chú: + rất cần, - tùy theo nhu cầu)1. Phòng rửa và cất nước + Máy cất nước 1 lần (8 L/giờ) + Máy cất nước 2 lần (4 L/giờ) - Máy sản xuất nước khử ion2. Phòng sấy hấp + Tủ sấy 60-300oC + Nồi khử trùng (autoclave) loại nhỏ (25 L) - Nồi khử trùng loại lớn (50-100 L)3. Phòng chuẩn bị môi trường + pHmeter 154 + Máy khuấy từ + Cân phân tích 10-4g + Cân kỹ thuật 10-2g + Bếp điện - Microwave + Tủ lạnh 100-200 L - Tủ lạnh sâu (-20  -80oC)4. Phòng cấy vô trùng + Tủ cấy vô trùng (Laminar, Clean Bench) + Quạt thông gió + Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường (1,2 m) - Thiết bị lọc không khí5. Phòng ảnh - Máy ảnh kỹ thuật số - Hệ thống đèn chiếu 1556. Phòng kính hiển vi + Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần). + Kính hiển vi đảo ngược (độ phóng đại 1000 lần) cógắn máy chụp ảnh kỹ thuật số. + Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần). - Microtome và các dụng cụ quan sát tế bào học. - Kính hiển vi huỳnh quang7. Phòng nuôi + Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếusáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux. + Máy điều hòa nhiệt độ - Máy lắc nằm ngang (100-200 vòng/phút) + Tủ ấm - Nồi phản ứng sinh học (bioreactor)8. Phòng sinh hóa + Máy sắc ký (HPLC, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng...) 156 + Thiết bị điện di gel (agarose và polyacrylamide) + Máy chụp ảnh, phân tích và lưu trữ hình ảnh củaDNA, RNA và protein (Gene documentation system) + Máy quang phổ có dải đo từ 190-1100 nm - Một số thiết bị khác để phân tích thành phần sinhhóa của các tế bào và mô nuôi cấy.II. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật Có 3 nhân tố chính: - Bảo đảm điều kiện vô trùng. - Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúngcách. - Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và saukhi cấy.1. Bảo đảm điều kiện vô trùng1.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thựcvật 157 Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật cóchứa đường, muối khoáng, vitamin... rất thích hợp cho cácloại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào củanấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với các tế bào thựcvật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bàotử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toànbộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặcnhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trongđiều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần. Thông thường, một chu kỳ nuôi cấy mô và tế bàothực dài từ 1-5 tháng (tùy đối tượng và mục đích nuôi cấy),trong khi thí nghiệm vi sinh vật có thể kết thúc trong mộtvài ngày. Nói cách khác, mức độ vô trùng trong thí nghiệmnuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghi ...