Tối ưu hóa sự chuyển nạp gen ở lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Số trang: 9
Loại file: pdf
Dung lượng: 1.06 MB
Lượt xem: 6
Lượt tải: 0
Xem trước 2 trang đầu tiên của tài liệu này:
Thông tin tài liệu:
Nghiên cứu này tiến hành tối ưu hóa một số nhân tố chính ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium trên lan Dendrobium Sonia như môi trường tái sinh và tăng trưởng PLBs, nồng độ AS, thời gian đồng nuôi cấy, chủng vi khuẩn, nồng độ kháng sinh diệt khuẩn và sàng lọc mô chuyển gen.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tối ưu hóa sự chuyển nạp gen ở lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensTẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 257-265TỐI ƯU HÓA SỰ CHUYỂN NẠP GEN Ở LAN Dendrobium SoniaQUA TRUNG GIAN VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciensNguyễn Xuân Dũng1*, Dương Hoa Xô1, Chu Hoàng Hà21Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh, *nguyenxuandung294@gmail.com2Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt NamTÓM TẮT: Trong nghiên cứu này, sự chuyển nạp gen được thiết lập trên protocorm like bodies (PLBs) ởhoa lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa vector pCambia1301 có mang gen GUS và gen kháng kanamycin. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự chuyển nạp gen baogồm môi trường tái sinh và tăng trưởng PLBs, nồng độ acetosyringone (AS); thời gian đồng nuôi cấy;chủng Agrobacterium; nồng độ kháng sinh diệt khuẩn (cefotaxime) và sàng lọc mô chuyển gen(hygromycin) đã được khảo sát. Kết quả cho thấy, môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l NAA kết hợp với 0,5mg/l hay 0,3 mg/l BA thích hợp cho sự tái sinh PLBs từ lát cắt mô thân. Hiệu quả chuyển gen (tỷ lệ PLBsbiểu hiện gen GUS) cao nhất đạt được khi PLBs được lây nhiễm và đồng nuôi cấy với Agrobacterium trênmôi trường chứa 100 µM AS trong 3 ngày (với chủng EHA105 và C58) hay 4 ngày (với chủngLBA4404). Cefotaxime 300 mg/l và hygromycin 7-15 mg/l thích hợp cho sự diệt khuẩn và sàng lọc PLBschuyển gen.Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Dendrobium Sonia, chuyển nạp gen, tái sinh PLBs.MỞ ĐẦULan Dendrobium Sonia, một dòng lai giữalan Dendrobium Caesar và Dendrobium TomieDrake [14], được trồng phổ biến ở Việt Namcho mục đích sản xuất hoa cắt cành. Cho đếnnay, nhu cầu của thị trường đối với hoa lanDendrobium Sonia vẫn không ngừng gia tăng,vì vậy, việc nghiên cứu chuyển gen nhằm cảithiện chất lượng loài lan này là một vấn đề có ýnghĩa quan trọng. Có hai phương pháp chuyểngen thường được sử dụng trên hoa lan đó là sửdụng súng bắn gen và vi khuẩn Agrobacteriumtumefaciens. Trong đó, phương pháp chuyểngen qua trung gian vi khuẩn Agrobacteriumhiện đang được quan tâm do tính hiệu quả củanó. Đã có nhiều nghiên cứu chuyển gen quatrung gian vi khuẩn Agrobacterium trên lanDendrobium [1, 2, 3, 8, 15], và một số loài lankhác như Hồ điệp [6, 9, 12], Vanda [12],Cattleya [16], Oncidium [7, 11], Cymbidium [4]MSCđược công bố trên thế giới. Tuy nhiên, cácnghiên cứu chuyển gen sử dụng vi khuẩnAgrobacterium trên lan Dendrobium Sonia hầunhư chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam.Việc nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyểngen vào loài lan này là thật sự cần thiết, tạo tiềnđề cho các nghiên cứu tiếp theo. Nghiên cứunày tiến hành tối ưu hóa một số nhân tố chínhảnh hưởng đến quá trình chuyển gen qua trunggian vi khuẩn Agrobacterium trên lanDendrobium Sonia như môi trường tái sinh vàtăng trưởng PLBs, nồng độ AS, thời gian đồngnuôi cấy, chủng vi khuẩn, nồng độ kháng sinhdiệt khuẩn và sàng lọc mô chuyển gen.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUĐoạn thân (giả hành) của cây lanDendrobium Sonia trồng tại vườn ươm củaTrung tâm Công nghệ sinh học thành phốHồ Chí Minh được sử dụng làm vật liệu.GUS first exon Catalase intronLBRBHYR(R)CAM35SLAC Z35S proGUSNOSHình 1. Cấu trúc vùng T-DNA trên vector pCambia 1301257Nguyen Xuan Dung, Duong Hoa Xo, Chu Hoang HaSử dụng các chủng vi khuẩn Agrobacteriumtumefaciens LBA4404, EHA105, C58 mangvector pCambia 1301 với vùng T-DNA chứagen GUS và gen kháng hygromycin (hình 1).Khảo sát môi trường thích hợp cho sự tái sinhtạo PLBs từ lát cắt mỏng đoạn thân lanDendrobium Sonia nuôi cấy in vitroĐoạn thân ở vị trí giữa hai chồi ngủ của câylan Dendrobium Sonia in vitro (cao 3-5 cm)được tách và cắt thành những lát mỏng (0,5mm) theo hướng vuông góc với chiều dài đoạnthân. Các lát cắt mỏng sau đó được đặt nuôi cấytrên môi trường MS [10] có bổ sung chất điềuhòa sinh trưởng BA ở các nồng độ từ 0,1-0,3mg/l kết hợp lần lượt với NAA ở các nồng độ từ0,5-5 mg/l. Mẫu cấy được đặt ở điều kiện ánhsáng 2.500±500 lux, nhiệt độ 25±2oC, ẩm độ50±5%. Theo dõi sự phát sinh PLBs sau 4 tuầnnuôi cấy. Thí nghiệm được lập lại 3 lần với sốlượng 3 bình/công thức/lần lập lại.Khảo sát môi trường thích hợp cho sự tăng sinhvà phát triển PLBsCác PLBs (đường kính khoảng 1,0 mm) củalan Dendrobium Sonia được nuôi cấy trên môitrường MS có bổ sung BA ở các nồng độ 0,1;0,3 và 0,5 mg/l kết hợp lần lượt với NAA ởnồng độ 1,0 mg/l. Mẫu cấy được nuôi cấy ởđiều kiện ánh sáng 2.500±500 lux, nhiệt độ25±2oC, ẩm độ 50±5%. Theo dõi sự tăng trưởngcủa PLBs sau 10 tuần nuôi cấy.Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứngAS, thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩnlên khả năng chuyển gen vào PLBsChuẩn bị vi khuẩn cho chuyển genVi khuẩn được tăng sinh qua đêm trong môitrường LB (3 ml) có bổ sung 50 mg/lkanamycin và 50 mg/l rifamicin, ở 28oC, tốc độlắc 250 vòng/phút. Mẫu vi khuẩn sau khi tăngsinh, sẽ được kiểm tra OD để đảm bảo giá trịOD ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tối ưu hóa sự chuyển nạp gen ở lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensTẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 257-265TỐI ƯU HÓA SỰ CHUYỂN NẠP GEN Ở LAN Dendrobium SoniaQUA TRUNG GIAN VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciensNguyễn Xuân Dũng1*, Dương Hoa Xô1, Chu Hoàng Hà21Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh, *nguyenxuandung294@gmail.com2Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt NamTÓM TẮT: Trong nghiên cứu này, sự chuyển nạp gen được thiết lập trên protocorm like bodies (PLBs) ởhoa lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa vector pCambia1301 có mang gen GUS và gen kháng kanamycin. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự chuyển nạp gen baogồm môi trường tái sinh và tăng trưởng PLBs, nồng độ acetosyringone (AS); thời gian đồng nuôi cấy;chủng Agrobacterium; nồng độ kháng sinh diệt khuẩn (cefotaxime) và sàng lọc mô chuyển gen(hygromycin) đã được khảo sát. Kết quả cho thấy, môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l NAA kết hợp với 0,5mg/l hay 0,3 mg/l BA thích hợp cho sự tái sinh PLBs từ lát cắt mô thân. Hiệu quả chuyển gen (tỷ lệ PLBsbiểu hiện gen GUS) cao nhất đạt được khi PLBs được lây nhiễm và đồng nuôi cấy với Agrobacterium trênmôi trường chứa 100 µM AS trong 3 ngày (với chủng EHA105 và C58) hay 4 ngày (với chủngLBA4404). Cefotaxime 300 mg/l và hygromycin 7-15 mg/l thích hợp cho sự diệt khuẩn và sàng lọc PLBschuyển gen.Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Dendrobium Sonia, chuyển nạp gen, tái sinh PLBs.MỞ ĐẦULan Dendrobium Sonia, một dòng lai giữalan Dendrobium Caesar và Dendrobium TomieDrake [14], được trồng phổ biến ở Việt Namcho mục đích sản xuất hoa cắt cành. Cho đếnnay, nhu cầu của thị trường đối với hoa lanDendrobium Sonia vẫn không ngừng gia tăng,vì vậy, việc nghiên cứu chuyển gen nhằm cảithiện chất lượng loài lan này là một vấn đề có ýnghĩa quan trọng. Có hai phương pháp chuyểngen thường được sử dụng trên hoa lan đó là sửdụng súng bắn gen và vi khuẩn Agrobacteriumtumefaciens. Trong đó, phương pháp chuyểngen qua trung gian vi khuẩn Agrobacteriumhiện đang được quan tâm do tính hiệu quả củanó. Đã có nhiều nghiên cứu chuyển gen quatrung gian vi khuẩn Agrobacterium trên lanDendrobium [1, 2, 3, 8, 15], và một số loài lankhác như Hồ điệp [6, 9, 12], Vanda [12],Cattleya [16], Oncidium [7, 11], Cymbidium [4]MSCđược công bố trên thế giới. Tuy nhiên, cácnghiên cứu chuyển gen sử dụng vi khuẩnAgrobacterium trên lan Dendrobium Sonia hầunhư chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam.Việc nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyểngen vào loài lan này là thật sự cần thiết, tạo tiềnđề cho các nghiên cứu tiếp theo. Nghiên cứunày tiến hành tối ưu hóa một số nhân tố chínhảnh hưởng đến quá trình chuyển gen qua trunggian vi khuẩn Agrobacterium trên lanDendrobium Sonia như môi trường tái sinh vàtăng trưởng PLBs, nồng độ AS, thời gian đồngnuôi cấy, chủng vi khuẩn, nồng độ kháng sinhdiệt khuẩn và sàng lọc mô chuyển gen.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUĐoạn thân (giả hành) của cây lanDendrobium Sonia trồng tại vườn ươm củaTrung tâm Công nghệ sinh học thành phốHồ Chí Minh được sử dụng làm vật liệu.GUS first exon Catalase intronLBRBHYR(R)CAM35SLAC Z35S proGUSNOSHình 1. Cấu trúc vùng T-DNA trên vector pCambia 1301257Nguyen Xuan Dung, Duong Hoa Xo, Chu Hoang HaSử dụng các chủng vi khuẩn Agrobacteriumtumefaciens LBA4404, EHA105, C58 mangvector pCambia 1301 với vùng T-DNA chứagen GUS và gen kháng hygromycin (hình 1).Khảo sát môi trường thích hợp cho sự tái sinhtạo PLBs từ lát cắt mỏng đoạn thân lanDendrobium Sonia nuôi cấy in vitroĐoạn thân ở vị trí giữa hai chồi ngủ của câylan Dendrobium Sonia in vitro (cao 3-5 cm)được tách và cắt thành những lát mỏng (0,5mm) theo hướng vuông góc với chiều dài đoạnthân. Các lát cắt mỏng sau đó được đặt nuôi cấytrên môi trường MS [10] có bổ sung chất điềuhòa sinh trưởng BA ở các nồng độ từ 0,1-0,3mg/l kết hợp lần lượt với NAA ở các nồng độ từ0,5-5 mg/l. Mẫu cấy được đặt ở điều kiện ánhsáng 2.500±500 lux, nhiệt độ 25±2oC, ẩm độ50±5%. Theo dõi sự phát sinh PLBs sau 4 tuầnnuôi cấy. Thí nghiệm được lập lại 3 lần với sốlượng 3 bình/công thức/lần lập lại.Khảo sát môi trường thích hợp cho sự tăng sinhvà phát triển PLBsCác PLBs (đường kính khoảng 1,0 mm) củalan Dendrobium Sonia được nuôi cấy trên môitrường MS có bổ sung BA ở các nồng độ 0,1;0,3 và 0,5 mg/l kết hợp lần lượt với NAA ởnồng độ 1,0 mg/l. Mẫu cấy được nuôi cấy ởđiều kiện ánh sáng 2.500±500 lux, nhiệt độ25±2oC, ẩm độ 50±5%. Theo dõi sự tăng trưởngcủa PLBs sau 10 tuần nuôi cấy.Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứngAS, thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩnlên khả năng chuyển gen vào PLBsChuẩn bị vi khuẩn cho chuyển genVi khuẩn được tăng sinh qua đêm trong môitrường LB (3 ml) có bổ sung 50 mg/lkanamycin và 50 mg/l rifamicin, ở 28oC, tốc độlắc 250 vòng/phút. Mẫu vi khuẩn sau khi tăngsinh, sẽ được kiểm tra OD để đảm bảo giá trịOD ...
Tìm kiếm theo từ khóa liên quan:
Tạp chí Khoa học Tạp chí sinh học Công nghệ sinh học Agrobacterium tumefaciens Dendrobium Sonia cCuyển nạp genGợi ý tài liệu liên quan:
-
68 trang 283 0 0
-
6 trang 277 0 0
-
Thống kê tiền tệ theo tiêu chuẩn quốc tế và thực trạng thống kê tiền tệ tại Việt Nam
7 trang 264 0 0 -
5 trang 231 0 0
-
Tiểu luận: Trình bày cơ sở khoa học và nội dung của các học thuyết tiến hóa
39 trang 216 0 0 -
10 trang 208 0 0
-
Quản lý tài sản cố định trong doanh nghiệp
7 trang 202 0 0 -
6 trang 192 0 0
-
Khách hàng và những vấn đề đặt ra trong câu chuyện số hóa doanh nghiệp
12 trang 188 0 0 -
8 trang 186 0 0