Tổng hợp và biểu hiện gen caf1 mã hóa kháng nguyên f1 của vi khuẩn Yersinia pestis

Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm tạo kháng nguyên F1 của Y. pestis để làm nguyên liệu cho que thử sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh Y. pestis. Do việc nuôi cấy Y. pestis để thu nhận kháng nguyên F1 hoặc DNA của vi khuẩn này rất khó khăn nên chúng tôi đã tiến hành tổng hợp nhân tạo gen mục tiêu caf1, mã hóa kháng nguyên F1, nhằm biểu hiện trong tế bào Escherichia coli.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tổng hợp và biểu hiện gen caf1 mã hóa kháng nguyên f1 của vi khuẩn Yersinia pestisTạp chí Công nghệ Sinh học 14(2): 353-359, 2016TỔNG HỢP VÀ BIỂU HIỆN GEN CAF1 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN F1 CỦA VI KHUẨNYERSINIA PESTISNguyễn Thị Thu Hà1, Nguyễn Phượng Minh1, Lê Trọng Tài1, Phạm Tiến Dũng2, Lê Quang Hòa212Viện Hóa học, Môi trường Quân sự, Bộ Tư lệnh Hóa họcViện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà NộiNgày nhận bài: 05.4.2016Ngày nhận đăng: 20.6.2016TÓM TẮTVi khuẩn Yersinia pestis là tác nhân gây bệnh dịch hạch, một trong những loại bệnh truyền nhiễm nguyhiểm nhất được biết cho đến nay đã gây ra hàng triệu ca tử vong trên thế giới và có thể được sử dụng nhưmột vũ khí sinh học có tính hủy diệt cao. Để chẩn đoán bệnh dịch hạch ở người cũng như phát hiện Y. pestistrong môi trường, người ta thường dựa trên việc phát hiện kháng nguyên nang F1 của loại vi khuẩn này.Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm tạo kháng nguyên F1 của Y. pestis để làm nguyên liệu cho que thử sắcký miễn dịch phát hiện nhanh Y. pestis. Do việc nuôi cấy Y. pestis để thu nhận kháng nguyên F1 hoặc DNAcủa vi khuẩn này rất khó khăn nên chúng tôi đã tiến hành tổng hợp nhân tạo gen mục tiêu caf1, mã hóakháng nguyên F1, nhằm biểu hiện trong tế bào Escherichia coli. Sau khi tối ưu hóa mã bộ ba mã hóa aminoacid (codon) cho E. coli, gen caf1 đã được tổng hợp bằng phương pháp “gapless” PCR. Kết quả giải trình tựcho thấy phương pháp này cho phép tổng hợp được trình tự gen mục tiêu với độ chính xác là 2/6 dòngplasmid. Tiếp đó, trình tự gen này đã được đưa vào vector pET-52b(+) và biểu hiện trong tế bào E. coliBL21 (DE3) ở dạng dung hợp với đuôi ái lực (His)10. Các kết quả điện di protein SDS-PAGE, tinh sạchprotein bằng sắc ký ái lực Ni và Western blot cho thấy kháng nguyên tái tổ hợp F1 đã được tạo ra thànhcông với hiệu suất lớn ở dạng thể vùi trong tế bào E. coli.Từ khóa: Biểu hiện, dịch hạch, kháng nguyên F1, tổng hợp gen, Yersinia pestisMỞ ĐẦUDịch hạch là một bệnh truyền nhiễm tiến triển cấptính, cực kỳ nguy hiểm do vi khuẩn Yersinia pestisgây ra. Bệnh lưu hành trong quần thể một số loài độngvật gặm nhấm (chủ yếu là chuột) và bọ chét ký sinhtrên chúng rồi từ đó lây truyền sang người qua trunggian bọ chét nhiễm khuẩn. Trong lịch sử loài ngườiđược ghi nhận cho đến nay, dịch hạch là loại bệnhtruyền nhiễm với số ca tử vong cao nhất (khoảng 200triệu ca) (Perry, Fetherston, 1997). Hiện nay, bệnhdịch hạch vẫn đang lưu hành rải rác tại một số quốcgia trên thế giới. Trong những năm gần đây, tại ViệtNam không ghi nhận trường hợp nào mắc bệnh dịchhạch. Tuy nhiên, nguy cơ lây lan bệnh dịch hạch từnước ngoài vào Việt Nam là rất lớn. Mặt khác, Y.pestis còn có thể được sử dụng như vũ khí sinh họcvới tính hủy diệt rất lớn, gây lo ngại cho cộng đồngquốc tế đặc biệt trong thời điểm hiện nay khi các vụkhủng bố liên tiếp diễn ra trên thế giới.Về tác nhân gây bệnh, Y. pestis là trực khuẩn,Gram âm, không di động, không hình thành bào tửthuộc họ Enterobacteriaceae. Ở người và động vật,vi khuẩn này sinh trưởng trong đại thực bào, lan tràntrong các tế bào dạng biểu mô sau đó lan ra toàn bộcơ thể (Zhou et al., 2006). Sau khi nhiễm vào cơ thể,Y. pestis tiết ra một protein nang được gọi là khángnguyên F1, chỉ có ở Y. pestis. Do vậy, kháng nguyênnày thường được sử dụng trong chẩn đoán bệnh dịchhạch hay phát hiện Y. pestis trong môi trường. Ở Y.pestis, quá trình tổng hợp và tiết kháng nguyên F1được mã hóa bởi operon F1 bao gồm 4 gen caf1,caf1M, caf1A và caf1R nằm trên plasmid pMT1,trong đó caf1 mã hóa kháng nguyên F1, caf1M vàcaf1A đóng vai trò trong việc tạo cấu trúc và tiếtprotein ra bên ngoài tế bào, caf1R đóng vai trò trongđiều hòa quá trình phiên mã các gen trên operon(Zhou et al., 2006). Về mặt cấu trúc, kháng nguyênF1 là một chuỗi polypeptide bao gồm 170 aminoacid, khối lượng phân tử từ 17-17,6 kDa, điểm đẳngđiện 4,1 - 4,4 (Andrews et al., 1996; Galyov et al.,1990). Kháng nguyên F1 là một protein có tính kịnước với cấu trúc bậc hai gấp nếp β (Andrews et al.,1996; Galyov et al., 1990).Nhằm tạo kháng nguyên F1 làm nguyên liệu đểchẩn đoán bệnh dịch hạch, nhiều nghiên cứu đã biểu353Nguyễn Thị Thu Hà et al.hiện protein kháng nguyên này trong tế bào E. coli(Andrews et al., 1996; Erova et al., 2013; Tsui et al.,2015). Cách tiếp cận được sử dụng phổ biến là biểuhiện toàn bộ operon trong E. coli để tạo khángnguyên F1 ở dạng ngoại bào tương tự như ở Y. pestis(Andrews et al., 1996; Tsui et al., 2015). Bên cạnhđó, Erova et al (2013) đã biểu hiện trực tiếp gen caf1trong nội bào của E. coli với việc sử dụng vectorbiểu hiện pET-20b(+) (Erova et al., 2013). Khi đượcbiểu hiện ở dạng dung hợp với đuôi ái lực (His)6 ởđầu cacboxyl, kháng nguyên F1 có thể được tạo ra ởtrạng thái hòa tan (Erova et al., 2013). Trong nghiêncứu này, để tránh các vấn đề liên quan đến an toànsinh học, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp nhân tạogen caf1 và đưa gen này và ...