Ứng dụng công nghệ sinh học trong xác định tính đồng nhất, tính khác biệt và tính ổn định của lúa phục vụ cho khảo nghiệm DUS

Cho đến nay, nhiều nước trên thế giới sử dụng hệ thống khảo nghiệm DUS dựa trên cơ sở các đặc điểm hình thái và hóa sinh. Tuy nhiên, một số quốc gia đã bắt đầu áp dụng phương pháp ADN dùng cho khảo nghiệm DUS (Navraj và.cs, 2009). Đối với công tác khảo nghiệm DUS ở nước ta, việc xây dựng một qui trình giám định giống chính xác ở mức độ phân tử là một việc làm hết sức cần thiết. Góp phần vào công tác khảo nghiệm DUS giống lúa nhằm xác định tính đúng giống, cũng như để tránh khỏi những.tranh cãi, đồng thời bảo hộ bản quyền tác giả, tác giả đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong xác định tính đồng nhất, tính ổn định và tính khác biệt của lúa phục vụ cho khảo nghiệm DUS.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Ứng dụng công nghệ sinh học trong xác định tính đồng nhất, tính khác biệt và tính ổn định của lúa phục vụ cho khảo nghiệm DUS Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG XÁC ĐỊNH TÍNH ĐỒNG NHẤT, TÍNH KHÁC BIỆT VÀ TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA LÚA PHỤC VỤ CHO KHẢO NGHIỆM DUS Lưu Minh Cúc, Lưu Thị Ngọc Huyền, Lê Huy Hàm Viện Di truyền Nông nghiệp SUMMARY (Application of biotechnology in identifying the distinctness, uniformity, stability of rice varieties to aid for DUS testing) This study aimed at developing procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of rice varieties to aid for DUS testing. The collection of 261 lines/varieties, which are abundant about sources, desease resistance, tolerance to biotic and abiotic stresses, were used in screening. Using the information from published data about DUS testing on rice in country around the world like China, Brazil, India..., walk along 12 rice chromosomes, 557 markers were selected. The use of those markers to screen with the large numbers of rice varieties were carried out. A strategy of upside down conical in many steps of screening was applied. At last, a reference set of DNA markers were selected. This set was including 30 markers. Procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of rice varieties to aid for DUS testing were developed. These procedures are tightly suitable to current DUS testing regulations. In addtion, a software namely DUS-DFP, with the DNA fingerprint data of 180 rice varieties base on 30 reference markers, was developed for applying all the results of this study in DUS testing purpose. Keywords: biotechnology, distinctness, uniformity, stability, DUS testing, rice. I. ĐẶT VẤN ĐỀ * Theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Quốc tế về Bảo vệ Giống cây trồng mới (International Union for the Protection of New Varieties of Plants), các cây trồng mới được chọn tạo phải trải qua khâu kiểm nghiệm theo tiêu chí DUS (bao gồm khảo nghiệm tính khác biệt distinctness, tính đồng nhất - uniformity và tính ổn định - stability). Trong 10 năm gần đây, mỗi năm Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia thường gặp phải tình trạng (5 - 10 trường hợp mỗi năm) các giống đưa ra khảo nghiệm có các đặc điểm hình thái (thỉnh thoảng cả đặc điểm hóa sinh) khó phân biệt. Trong một số trường hợp, giống cây trồng của các tác giả khác nhau hoặc được nhập nội có tên gọi khác nhau, nhưng về mặt hình thái lại rất giống nhau, gây ra những tranh cãi khó giải quyết. Câu hỏi đặt ra là thực chất chúng thuộc một giống hay các giống khác nhau? Các tiêu chí khảo nghiệm DUS truyền thống dựa trên 62 đặc điểm hình thái và hóa sinh cho thấy chưa đủ Người phản biện: TS. Lã Tuấn Nghĩa cơ sở để phân biệt các giống với nhau. Điều này gây nhiều khó khăn và cản trở trong việc xác minh bản quyền về giống cây trồng. Những tiến bộ gầy đây trong công nghệ sinh học nói chung và sinh học phân tử thực vật nói riêng đã có nhiều đóng góp tích cực không chỉ trong việc chọn tạo ra những giống cây trồng mới mà còn giúp phân biệt các đặc điểm di truyền của các bộ giống mới được chọn tạo hoặc giống nhập nội. Cho đến nay, nhiều nước trên thế giới sử dụng hệ thống khảo nghiệm DUS dựa trên cơ sở các đặc điểm hình thái và hóa sinh. Tuy nhiên, một số quốc gia đã bắt đầu áp dụng phương pháp ADN dùng cho khảo nghiệm DUS (Navraj và cs., 2009). Đối với công tác khảo nghiệm DUS ở nước ta, việc xây dựng một qui trình giám định giống chính xác ở mức độ phân tử là một việc làm hết sức cần thiết. Góp phần vào công tác khảo nghiệm DUS giống lúa nhằm xác định tính đúng giống, cũng như để tránh khỏi những tranh cãi, đồng thời bảo hộ bản quyền tác giả, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong xác định tính đồng nhất, tính ổn định và tính khác biệt của lúa phục vụ cho khảo nghiệm DUS. 251 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu - Tập đoàn 261 giống lúa thu thập - 40 giống lúa để đánh giá DUS - 180 giống lúa để lập cơ sở dữ liệu - 19 giống lúa điển hình của Trung tâm Khảo nghiệm. - 19 giống lúa giống nhau theo cặp trong khảo nghiệm DUS năm 2010- 2012 - Tổng số 557 chỉ thị phân tử đã dùng để khảo sát lập bộ chỉ thị tham chiếu - Các vật tư hoá chất sinh học phân tử chuyên dụng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB cải tiến (của Phòng thí nghiệm Di truyền học, Trường Đại học Gent, Bỉ). - Phương pháp PCR (Michael and Simon 2006). - Điện di gel polyacrylamide biến tính và không biến tính (PTN IRRI-Phillipine). - Thí nghiệm đồng ruộng được tiến hành theo Quy phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định của giống lúa 10TCN 554-2002. - Các biện pháp kỹ thuật khác được tiến hành theo Quy phạm khảo nghiệm giá trị canh tác và giá trị sử dụng giống lúa 10TCN 558-2002. - Xử lý số liệu thu được bằng phân tích trên phần mềm POPGEN 1.31 và NTSYS 2.1, Power Marker 3.0. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu xác định nguồn vật liệu và thiết lập bộ chỉ thị tham chiếu Đề tài đã thu thập được tập đoàn 261 dòng/giống lúa để sử dụng trong đề tài nhằm sàng lọc tìm kiếm các alen có thể có trên các giống lúa đối với các chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu. Bước đầu tiên, nghiên cứu tiến hành khảo sát 261 giống lúa thu thập từ nhiều nguồn khác nhau đối với 100 chỉ thị gồm 81 chỉ thị SSR rải rác trên 12 NST có số lượng từ 3-8 alen và 19 chỉ thị thiết kế khi nghiên cứu vùng bảo thủ của các 252 promoter tập trung vào các cis-element hay chính là trình tự điều khiển để nhân tố phiên mã bám vào và điều hòa biểu hiện gene và các EST ở lúa. Mở rộng phạm vi tìm kiếm, bước tiếp theo được tiến hành với 152 chỉ thị InDel marker được thiết kế dựa trên sự so sánh trình tự hệ gen của giống lúa Indica 93-11 và giống lúa Japonica Nipponbare, có thể xác định được sự đa hình từ các đột biến thêm/bớt (insertion/delection) trong hệ gen lúa. Đây chính là những chỉ thị đa hình cao và hoạt động t ...