Ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP trong định nhóm HLA

Phức hệ chủ yếu hoà hợp mô ở ng-ời chiếm một vùng kho.ng từ 4 đến 5 megabaes (Mb) trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6. Trong lịch sử, kháng nguyên bạch cầu ng-ời (HLA: Human leucocyt Antigen) đ-ợc xác định bằng huyết thanh học, sau đó là kỹ thuật tế bào, kỹ thuật tính đa dạng các m.nh do men hạn chế(Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLP). Ngày nay, kỹ thuật đ-ợc sử dụng nhiều và có độ tin cậy cao là oligonucleotid probe. Phân tử HLA rất đa dạng, các kháng nguyên này gây ra c. miễn...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP trong định nhóm HLA TCNCYH 23 (3) 2003 øng dông kü thuËt PCR-SSP trong ®Þnh nhãm HLA TS. B¹ch Kh¸nh Hoµ Labo trung t©m y sinh häc, §¹i häc Y Hµ Néi Phøc hÖ chñ yÕu hoµ hîp m« ë ng−êi chiÕm mét vïng kho¶ng tõ 4 ®Õn 5 megabaes (Mb) trªnc¸nh ng¾n cña nhiÔm s¾c thÓ sè 6. Trong lÞch sö, kh¸ng nguyªn b¹ch cÇu ng−êi (HLA: Humanleucocyt Antigen) ®−îc x¸c ®Þnh b»ng huyÕt thanh häc, sau ®ã lµ kü thuËt tÕ bµo, kü thuËt tÝnh ®ad¹ng c¸c m¶nh do men h¹n chÕ(Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLP). Ngµy nay, küthuËt ®−îc sö dông nhiÒu vµ cã ®é tin cËy cao lµ oligonucleotid probe. Ph©n tö HLA rÊt ®a d¹ng,c¸c kh¸ng nguyªn nµy g©y ra c¶ miÔn dÞch thÓ dÞch vµ miÔn dÞch qua trung gian tÕ bµo. Trong bµi nµy chóng t«i tr×nh bµy kü thuËt: Ph¶n øng chuçi polymerase víi nh÷ng måi cã tr×nh tù®Æc hiÖu (PCR- SSP: Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Primers) ®Ó ®Þnh nhãm HLAnh»m môc ®Ých sö dông trong l©m sµng chän hoµ hîp ng−êi cho vµ ng−êi nhËn t¹ng mµ chóng t«i®· thùc hiÖn ë ViÖt Nam tõ 2000. 1. Më ®Çu: kh¸ng nguyªn miÔn dÞch b¹ch sinh häc ph©n tö nh»m x¸c ®Þnh tÝnh ®a d¹ngcÇu cña ng−êi (human leucocyte antigen- cña HLA béc lé trªn bÒ mÆt tÕ bµo.HLA) n»m mét phÇn quan träng trong hÖ thèng 2.1.Kü thuËt huyÕt thanh häc: nh÷ng n¨mdi truyÒn, ®−îc gäi lµ hÖ thèng chñ yÕu hoµ hîp 1954 lµ nh÷ng n¨m ®Çu t×m hiÓu vÒ hÖ thèngm« (complex major histocompatibilite – HLA, ng−êi ta chØ dïng ph¶n øng ng−ng kÕtCMH), hÖ thèng nµy n»m trªn c¸nh ng¾n cña b¹ch cÇu sau ®ã tiÕn thªm mét b−íc, ®ã lµ künhiÔm s¾c thÓ sè 6 (®o¹n 6p21.3). LÇn ®Çu tiªn thuËt vi ®éc tÕ bµo tiªu thô bæ thÓ. Dïng tÕ bµohÖ thèng nµy ®−îc ph¸t hiÖn bëi J.Dausset, b¹ch cÇu sau khi t¸ch qua Ficoll råi nhá vµo1958, vµ «ng ®· ®−îc nhËn gi¶i th−ëng Nobel c¸c giÕng ®· cã nh÷ng huyÕt thanh mang kh¸ngvÒ Y häc n¨m 1980 [1]. HLA cã vai trß chñ thÓ ®Æc hiÖu ®−îc biÕt tr−íc, sau ®ã nhá thªm®¹o trong ®¸p øng miÔn dÞch. TÝnh ®a d¹ng bæ thÓ thá sÏ dÉn ®Õn hiÖn t−îng chÕt tÕ bµotrong cÊu tróc ®· dÉn ®Õn nh÷ng khã kh¨n nÕu cã ph¶n øng kh¸ng nguyªn kh¸ng thÓ vµtrong x¸c ®Þnh kh¸ng nguyªn vµ hiÓu biÕt vÒ x¸c ®Þnh hiÖn t−îng nµy th«ng qua nhuém tÕchøc n¨ng cña nã øng dông trong l©m sµng. bµo b»ng thuèc nhuém, ®äc kÕt qu¶ d−íi kÝnhVai trß cña HLA trong sù nhËn biÕt c¸i t«i vµ hiÓn vi ®¶o ng−îc. Cho ®Õn nay kü thuËt nµykh«ng ph¶i t«i rÊt quan träng trong ghÐp c¬ vÉn ®−îc sö dông ë nhiÒu phßng xÐt nghiÖm.quan, ghÐp tuû, còng nh− ®¸p øng miÔn dÞch ë Trong bµi nµy chóng t«i ®Ò cËp ®Õn nh÷ngmøc ®é peptit. Nh− vËy, víi nh÷ng cÊu tróc vµ kü thuËt ®ang ®−îc sö dông nhiÒu nhÊt, ®ã lµchøc n¨ng kh¸c nhau ph©n tö HLA gióp cho nh÷ng kü thuËt vÒ sinh häc ph©n tö.chóng ta hiÓu ngµy cµng râ h¬n c¬ chÕ ®¸p øng 2.2. Sù ph¸t triÓn ngµy cµng gia t¨ng trongmiÔn dÞch. nu«i cÊy dßng tÕ bµo th× sù hiÓu biÕt gen cña 2. Kü thuËt ®Þnh nhãm HLA: tr¶i qua líp I (1980) vµ líp II (1982) còng ngµy cµngnhiÒu giai ®o¹n kÓ tõ khi ph¸t minh ra hÖ thèng s©u s¾c h¬n gióp cho gi¶i thÝch ®−îc ADN bæHLA cho ®Õn nay cã rÊt nhiÒu kü thuËt ®· ®−îc sung vµ bé gen (genomique) cho phÐp chóng ta¸p dông trong viÖc x¸c ®Þnh kh¸ng nguyªn cña sö dông sonde thø hai cña HLA.Ng−êi ta cã thÓhÖ thèng nµy, ng−êi ta t¹m chia nã ra lµm hai sö dông sond nµy trong ph¶n øng lai víi ADNnhãm: kü thuËt huyÕt thanh häc vµ kü thuËt cña bé gen ®Ó nghiªn cøu tÝnh ®a d¹ng cña lociTiÕn sÜ, phã tr−ëng Labo Trung t©m Y sinh häc – tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi.130TCNCYH 23 (3) 2003hay cña allen. Kü thuËt sinh häc ph©n tö ®Çu 2.3. Kü thuËt PCR-SSP: ngµy nay trongtiªn ®−îc ¸p dông trong ®Þnh nhãm HLA dùa nhiÒu phßng thÝ nghiÖm hoµ hîp m« trªn thÕtrªn sù ph©n tÝch sè l−îng vµ kÝch th−íc ®o¹n giíi ng−êi ta sö dông kü thuËt PCR lµ kü thuËtADN lai víi sond ®Æc hiÖu cña HLA sau khi th−êng quy ®Ó ®Þnh nhãm kh¸ng nguyªn b¹chnã bÞ c¾t bëi enzym giíi h¹n. Kü thuËt nµy gäi cÇu, 1999 Ph¹m §¨ng Khoa, Vò TriÖu An vµtªn lµ tÝnh ®a d¹ng c¸c m¶nh do men h¹n chÕ céng sù cña bé m«n MiÔn dÞch- Sinh lý bÖnh“(RFLP) [2]. §©y lµ kü thuËt ®Þnh nhãm HLA tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi ®· thùc hiÖn kü thuËt®−îc sö dông chñ yÕu trong workshop-HLA nµy ®Ó ®Þnh nhãm DRB1 [2]. Tõ th¸ng 10-1997, vµ cho thÊy cã nhiÒu tiÕn bé quan träng, 2000 t¹i phßng thÝ nghiÖm Y Sinh häc cñanhÊt lµ trong x¸c ®Þnh vµ nghiªn cøu tÝnh ®a tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi, chóng t«i còng ®−ad¹ng cña líp II, trong ghÐp c¬ quan vµ tæ chøc. vµo thùc hiÖn kü thuËt PCR-SSP ®Ó ®Þnh nhãmKü thuËt RFLP còng lÇ ...