Ứng dụng phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp tạo vi giọt (droplet digital PCR) trong phân tích đột biến gen phục vụ điều trị đích ung thư

Bài viết trình bày việc xây dựng phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp với tạo vi giọt (digital droplet PCR, ddPCR) nhằm phân tích các đột biến liên quan đến điều trị đích UT phổi trên gen EGFR từ các mẫu sinh thiết lỏng (ctDNA). Phương pháp ddPCR được xây dựng có ngưỡng phát hiện đột biến ở tần suất 0.5-1% (nghĩa là 5-10 phân tử DNA ung thư trong 10.000 phân tử DNA bình thường).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Ứng dụng phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp tạo vi giọt (droplet digital PCR) trong phân tích đột biến gen phục vụ điều trị đích ung thư GIẢI PHẪU BỆNH ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR KỸ THUẬT SỐ KẾT HỢP TẠO VI GIỌT (DROPLET DIGITAL PCR) TRONG PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN PHỤC VỤ ĐIỀU TRỊ ĐÍCH UNG THƯ TRẦN LÊ SƠN1,2, PHẠM THỊ HỒNG ANH1, TRẦN THANH TRƯỜNG1, TRẦN VŨ UYÊN1, ĐẶNG MAI ANH TUẤN3, ĐINH NGUYỄN THIÊN KIM4, PHAN VĂN HIẾU3, GIANG HOA1,2, NGUYỄN HOÀI NGHĨA5TÓM TẮT Thuốc điều trị ung thư (UT) thuộc nhóm ức chế hoạt tính của enzyme tyrosine kinase (tyrosine kinaseinhibitor, TKI) được cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (FDA) phê duyệt cho điều trị UT phổi không tếbào nhỏ. Nghiên cứu lâm sàng cho thấy các bệnh nhân UT mang những kiểu đột biến đặc trưng cho đáp ứngkhác nhau với các thế hệ thuốc TKI khác nhau và sau một thời gian điều trị biểu hiện các đột biến kháng thuốcmới. Do đó, việc xác định các kiểu đột biến đặc trưng này rất quan trọng cho dự đoán và đề ra liệu pháp điều trịtrúng đích hiệu quả, đồng thời theo dõi đáp ứng của bệnh nhân trong quá trình điều trị lâm sàng. Sinh thiết môu hiện vẫn là phương pháp chuẩn vàng cho xác định các đột biến gen. Tuy nhiên, trở ngại lớn nhất của phươngpháp xâm lấn này là khó tiến hành lấy mẫu nhiều lần và trong nhiều trường hợp không thể thu nhận đủ mô ucho phân tích di truyền. Gần đây phương pháp sinh thiết lỏng dựa trên việc phát hiện các DNA ngoại bào đượcphóng thích từ tế bào ung thư (circulating tumor DNA, ctDNA) cho phép phân tích di truyền của khối u. Tuynhiên do tỉ lệ DNA phóng thích bởi các tế bào UT so với DNA của các loại tế bào khác thường rất thấp nên cầnmột phương pháp có độ nhạy cao để có thể phát hiện các đột biến với tần suất thấp. Trong nghiên cứu này,chúng tôi xây dựng phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp với tạo vi giọt (digital droplet PCR, ddPCR) nhằmphân tích các đột biến liên quan đến điều trị đích UT phổi trên gen EGFR từ các mẫu sinh thiết lỏng (ctDNA).Phương pháp ddPCR được xây dựng có ngưỡng phát hiện đột biến ở tần suất 0.5-1% (nghĩa là 5-10 phân tửDNA ung thư trong 10.000 phân tử DNA bình thường). Qui trình ddPCR này được sử dụng để phát hiện độtbiến trên các mẫu sinh thiết lỏng và mô u của 43 bệnh nhân UT phổi không tế bào nhỏ. Phương pháp ddPCRcho kết quả tương đồng cao (87.5%) khi so sánh kết quả phân tích đột biến từ các mẫu sinh thiết lỏng và mô utương ứng của cùng bệnh nhân. Như vậy, ddPCR là phương pháp có độ nhạy cao, đơn giản và dễ dàng triểnkhai hỗ trợ quá trình điều trị UT lâm sàng.ABSTRACT Detection of clinically actionable mutations in cancer liquid biopsies using droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) Tyrosine kinase inhibitors (TKIs) are a series of pharmaceutical drugs approved by the Food and DrugAdministration (FDA) for treatment of many types of cancers including non-squamous cell lung cancer. Clinicalstudies showed that patients with somatic mutations in certain cancer driver genes exhibit strong correlationwith therapeutic efficacy to different types of TKIs and tend to acquire new mutations rendering resistance toprevious TKI therapies. Hence, the identification of such mutations is critically important for effective genotype-directed therapies and assessment of patients’ responses in clinical practice. Tumor biopsy remains the goldstandard for assessing genetic mutations in both lung and colorectal cancer. However, it is not always feasibleto obtain sufficient tumor tissue or perform repeat biopsy in these patients. Recently, “liquid biopsy” whichinvolves isolating cell free DNA released by cancer cells into the bloodstream (circulating tumor DNA, ctDNA)represents a noninvasive and potential technique for tumor genetic analysis. Due to the relatively low1 Công ty giải pháp gene2 Viện di truyền Y học3 Trung tâm Pháp Y TP.HCM4 Bệnh viện Đa khoa Tân Hưng5 Đại học Y dược TP.HCMTẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 229GIẢI PHẪU BỆNHabundance of ctDNA in the peripheral circulation, a highly sensitive genotyping assay is required to detect suchlow frequency mutations. In this study, we developed a novel digital droplet PCR (ddPCR) assays to identifyclinically actionable mutations of a cancer driver gene, EGFR. The limit of detection of our assays was 0.5-1%(5-10 target mutation DNA molecules in 10.000 wild type DNA molecules). These assays were further appliedto evaluate the sensitivity and specificity for detection of mutations in both plasma and matched formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples of 43 non-small cell lung cancer patients. Our results ...