Vai trò của các gen yếu tố phiên mã MG-XLNR liên quan đến hoạt động của các gen xylanases, cellulases và khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn Magnaporthe oryzae

Bài viết nghiên cứu sử dụng công cụ ức chế gen (RNA silencing) để ức chế sự biểu hiện của hai gen yếu tố phiên mã MG-XLNR của nấm đạo ôn. Phân tích bằng phương pháp Northern đã chỉ ra rằng các mức độ biểu hiện của hai gen này suy giảm với nhiều mức độ khác nhau ở các mẫu đột biến khi so sánh với đối chứng.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Vai trò của các gen yếu tố phiên mã MG-XLNR liên quan đến hoạt động của các gen xylanases, cellulases và khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn Magnaporthe oryzaeTẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 112-119VAI TRÒ CỦA CÁC GEN YẾU TỐ PHIÊN MÃ MG-XLNR LIÊN QUAN ĐẾNHOẠT ĐỘNG CỦA CÁC GEN XYLANASES, CELLULASES VÀ KHẢ NĂNG GÂYBỆNH CỦA NẤM ĐẠO ÔN Magnaporthe oryzaeNguyễn Bảo Quốc1*, Nguyễn Ngọc Bảo Châu21Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, Đại học Nông Lâm tp. Hồ Chí Minh,*baoquoc@hcmuaf.edu.vn2Trường Đại học Mở tp. Hồ Chí MinhTÓM TẮT: Yếu tố phiên mã XlnR có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát hoạt động của các gen liênquan đến enzyme phá huỷ thành tế bào (CWDEs) của nấm bệnh. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụngcông cụ ức chế gen (RNA silencing) để ức chế sự biểu hiện của hai gen yếu tố phiên mã MG-XLNR củanấm đạo ôn. Phân tích bằng phương pháp Northern đã chỉ ra rằng các mức độ biểu hiện của hai gen nàysuy giảm với nhiều mức độ khác nhau ở các mẫu đột biến khi so sánh với đối chứng. Sự suy giảm phân tửmRNA MG-XLNR trên các mẫu đột biến cũng dẫn đến sự suy giảm không chỉ các phân tử mRNA củaCWDEs như xylanases, cellulases mà cả hoạt động của những enzyme phân hủy thành tế bào này. Sự suygiảm các vết bệnh và mức độ lây lan của chúng trên lá cây ký chủ bị xâm nhiễm bởi các mẫu nấm đột biếnso với mẫu nấm đối chứng đã chỉ ra rằng các yếu tố phiên mã Mg-XlnR của nấm đạo ôn đóng vai trò rấtquan trọng trong việc kiểm soát hoạt động của các gen liên quan đến enzyme phá huỷ thành tế bào, đặcbiệt là các gen xylanases và đến khả năng gây bệnh trên cây trồng.Từ khóa: Bệnh đạo ôn, ức chế gen, yếu tố phiên mã.MỞ ĐẦUĐể lây nhiễm thành công, nấm gây bệnh đạoôn trên lúa thường hình thành các công cụ xâmnhiễm như bào tử, giác bám và cọc xâm nhiễmđể phá huỷ lớp biểu bì và thành tế bào thực vật[19]. Trong các công cụ xâm nhiễm của nấmđạo ôn, giác bám đóng vai trò rất quan trọngtrong giai đoạn đầu gây bệnh vì nó có thể tấncông tế bào cây ký chủ bằng cả hai cách là tạoáp lực và tiết các enzyme phá hủy thành tế bàotheo dạng cơ học và hoá học nhằm tạo điều kiệncho cọc xâm nhiễm tấn công vào bên trong đểlấy chất dinh dưỡng cho sự tồn tại và phát triểncủa nấm đạo ôn [6]. Việc sử dụng các enzymephân huỷ thành tế bào cây ký chủ của nấm bệnh(CWDEs) được xem là một công cụ rất hiệu quảđể vượt qua rào cản thành tế bào nhằm tạo điềukiện dễ dàng cho sự xâm nhiễm của nấm [22].Có hai nhóm chính của CWDEs đóng vai trò rấtquan trọng liên quan đến khả năng xâm nhiễmtheo chiều dọc và chiều ngang của nấm đạo ônlà endo-β-1,4 xylanases và cellulases [15, 21].Hai nhóm này thường là một họ bao gồm nhiềugen riêng lẻ qui định cùng một chức năng. Vìvậy, việc xác định chức năng của từng gen bằngphương pháp bất hoạt gen thường rất khó và112không hiệu quả do sự dư thừa chức năng. Cónhiều phương pháp để khắc phục tình trạng này,chẳng hạn như bất hoạt toàn bộ các gen riêng lẻtrong một họ nhằm tạo một đột biến bất hoạt đagen. Tuy nhiên phương pháp này rất khó, mấtthời gian và không khả thi. Một phương phápkhác là bất hoạt hoặc ức chế sự biểu hiện củacác gen yếu tố phiên mã như XlnR, ACEII kiểmsoát hoạt động của các họ gen liên quan đếnCWDEs [1]. Trong nghiên cứu này, chúng tôitập trung vào các gen dạng XlnR của nấm đạoôn. Gen XlnR được tìm thấy trên các nấmAspergillus niger, A. oryzae, Trichodermareesei, Fusarium oxysporum và có vai trò rấtrộng trong việc kiểm soát sự phiên mã của cácgen CWDEs mã hóa cho xylanases,endoglucanase và hemicellulase [9, 16, 20].Thông qua việc sử dụng công cụ BLAST, sựhiện diện của hai gen tương đồng dạng XlnR(MGG_01414.6 và MGG_02880.6, gọi chung làMg-XlnR) đã được xác định trong hệ gen củanấm gây bệnh đạo ôn, Magnaporthe oryzae.Chúng tôi sử dụng một công cụ di truyền ngượcgọi là ức chế sự biểu hiện của gen (RNAsilencing) để xác định chức năng của các genliên quan đến việc kiểm soát các hoạt động củaNguyen Bao Quoc, Nguyen Ngoc Bao ChauCWDEs trên nấm đạo ôn. Đồng ức chế hai gennày bằng việc sử dụng phương pháp chọn lọcmẫu đột biến ức chế (knock-down mutants) dựatrên GFP fluorescence đã được phát triển vàứng dụng trong các nghiên cứu trước đây [14,15], chúng tôi đã chỉ ra vai trò của các gen MgXlnR liên quan đến sự biểu hiện của các genCWDEs và khả năng gây bệnh của nấm đạo ônMagnaporthe oryzae. Việc tìm hiểu chức năngcủa hai gen Mg-XlnR này sẽ được tiến hành vàđánh giá trong nghiên cứu này.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUChủng nấm, môi trường nuôi cấy và chuyểngen trên nấmChủng nấm sử dụng trong nghiên cứu này làBr48-GFP một dạng chủng có nguồn gốc từBr48 (một nòi lây nhiễm trên cây lúa mì) nhưngcó sự hiện diện của gen chỉ thị GFP [7]. Nhữngchủng này được giữ trong môi trường PDA(potato dextrose agar) trong nhiều tháng. Cácchủng nấm này sẽ được nuôi cấy trong 100 mlmôi trường CM lỏng (0,3% casamino acids,0,3% yeast extract, 0,5% sucrose) ở 26oC choviệc chiết xuất RNA và tế bào nấm.Tế bào nấm được chiết xuất bằng cách sửdụng các enzyme có khả năng phân hủy thành tếbào nấm (Sigma-Aldrich) và chuyển gen trênnấm được tiến hành bằng phương pháppolyethylen glycol (PEG) đã được mô tả trướcđây [12]. Trong quá trình chọn lọc đột biến ứcchế gen, các mẫu nấm chuyển gen sẽ được nuôicấy trong đĩa 96 lỗ chứa môi trường PDA vàGFP fluorescence của chúng sẽ được đo bằngbằng máy Avro-SX (Perkin-Elmer, Hoa Kỳ) vớicác bước sóng kích thích và phát tán lần lượt là485 nm và 535 nm [14].Cấu trúc ức chế genMột đoạn DNA của gen MGG_01414.6 gầnvùng 3’ có chiều dài khoảng 429 bp có trình tựtương đồng cao với gen MGG_02880.6 đượckhuếch đại PCR bằng cặp mồi: (5’CATACTCCTGACGGGCAAGT 3’ và 5’CACCTGTAGAGGGCCAGAAG 3’) sử dụngDNA polymerase KOD Plus có khả năng hìnhthành sản phẩm dùng để nhân dòng theo kiểuthẳng đứng. Đoạn DNA sẽ được gắn vào cấutrúc pSD1G ở vị trí EcoRV [14] hình thành cấutrúc ức chế gen pSD1G-1414Phân tích Northern blotRNA tổng số của các mẫu nấm sẽ ...