Vector chuyển gen là cosmid

Các cosmid là những vector lai nhân tạo từ một plasmid với các trình tự cos của phage λ (được sử dụng từ năm 1978). Các trình tự cos này điều khiển sự đóng gói DNA tái tổ hợp vào đầu của phage. Khi bao gói các vùng cos đều bị cắt, chỉ còn một phần DNA của cosmid được giới hạn bởi các đầu dính với đoạn cài DNA lạ được bao gói. Trong phản ứng bao gói in vitro, các protein cần thiết cho sự tạo thành đầu và đuôi phải được thêm vào để cho các phage...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Vector chuyển gen là cosmid Vector chuyển gen là cosmidCác cosmid là những vector lai nhân tạo từ một plasmid với các trình tự coscủa phage λ (được sử dụng từ năm 1978). Các trình tự cos này điều khiển sựđóng gói DNA tái tổ hợp vào đầu của phage.Khi bao gói các vùng cos đều bị cắt, chỉ còn một phần DNA của cosmid đượcgiới hạn bởi các đầu dính với đoạn cài DNA lạ được bao gói. Trong phản ứngbao gói in vitro, các protein cần thiết cho sự tạo thành đầu và đuôi phải đượcthêm vào để cho các phage có thể tự hợp thành.Cosmid là những plasmid có các vùng giới hạn mà tại đây, người ta có thể càilắp DNA lạ và một gen chống chịu ampicilline. Kích thước cosmid ≈ 5kb dođó, nó có thể nhận được đoạn cài 35÷45kb và có thể tới 47kb (như chúng tađã thấy ở Mục 5.5.2.2, đầu của phage λ có thể bao gói được 52kb).Vào thời điểm gây nhiễm E. Coli, DNA tái tổ hợp được phóng vào vi khuẩn.Trong vi khuẩn các đầu dính sẽ bắt cặp tạo ra cosmid tái tổ hợp khép kíndạng vòng và tái bản như một plasmid.Ưu điểm và ứng dụng của cosmid:Cũng như phage, cosmid cho khả năng xâm nhiễm tế bào vi khuẩn lớn, nhậnđoạn cài có kích thước lớn. Cấu tạo cosmidTrong tế bào chủ, nó tự nhân bản như plasmid. Cho nên người ta nhận đượcnhững khuẩn lạc, chứ không phải đĩa phân giải trên mặt thạch, thuận lợi choviệc quan sát.Với những tiện lợi trên, người ta dùng cosmid để tách dòng từ những gen lớnđể tạo ngân hàng genom (bộ gen). Những vi khuẩn mang vector này có khảnăng chống chịu với môi trường có ampiciline.Các vector chuyển gen là phagePhage (thực khuẩn thể) là virus xâm nhiễm vi khuẩn làm phân giải vi khuẩn.Việc sử dụng phage làm vector chuyển gen có nhiều ưu điểm hơn so vớivector là plasmid: - Dễ xâm nhập vào vi khuẩn, - Khả năng nhân lên nhanh trong tế bào chủ, - Khả năng tiếp nhận đoạn DNA lạ lớn hơn plasmid.Tuy nhiên, việc sử dụng phage có nhiều bất lợi như: - Thao tác ghép DNA lạ phức tạp - DNA tái tổ hợp không tạo thành khuẩn lạc như DNA tái tổ hợp là plasmid, mà thành đĩa phân giải xuất hiện trên mặt thạch phủ đầy vi khuẩnPhần lớn các nhóm phage sử dụng làm vector đều bắt nguồn từ phage λ thuộcthế hệ thứ nhất.1. Phage λ (thế hệ đầu)Cấu tạo gồm hai phần: Phần đầu chứa DNA và được đóng gói trong vỏprotein. Phần đuôi cho phép virus có thể tự cố định trên các tế bào chủ là vikhuẩn: - DNA của phage: Sợi đôi, mạch thẳng, dài 48,5kb gồm hàng chục gen. Đầu tận cùng cuả DNA là sợi đơn gồm 12 nucleotide và chúng được gọi là những đầu dính. - Cũng như tất cả virus, DNA này được bao bọc trong vỏ protein.Phage sinh sôi nẩy nở theo hai cách: - Chu kỳ tan: phage được sinh sôi nẩy nở trong vi khuẩn. Các phage mới được tạo ra sẽ đi ra khỏi vi khuẩn bằng cách làm tan vi khuẩn này. - Sinh tan: Là một kiểu sinh sản khác của virus, phage không làm tiêu tan vi khuẩn, thay vì tự sinh sản trong tế bào chất, phage sát nhập DNA của mình với DNA của vi khuẩn.2. Các biến hình của phage λ (phage thế hệ sau)Các phage thuộc thế hệ thứ hai rất đa dạng, mỗi một loại thích ứng với mộtmục đích sử dụng.Giảm một số vùng hạn chế giống nhau:Phage λ tự nhiên (chưa biến hình) gọi là phage hoang dại có chứa nhiều vùnghạn chế giống nhau như: - 5 vùng EcoRI - Nhiều vùng Hind IIIKhông thể cắt vector này bằng EcoRI hoặc HindIII đề cài vào đây một mảnhDNA lạ. Người ta đã biến hình loại phage λ này chỉ còn chứa một vùng nhậnbiết của EcoRI tạo ra vector cài và hai vùng EcoRI tạo ra vector thay thế. Vídụ: - λ NM607 là vector cài chứa đoạn cài DNA dài 9kb ở vị trí cắt bởi EcoRI trong gen CI. - λ charon 16: DNA được cài vào vị trí EcoRI làm ức chế gen lacZ. - λ EMBL4 là một vector thay thế, đoạn DNA thay thế dài 23kb.Làm khuyết những phần không cần thiết:Phage λ chỉ có thể nhận được DNA lạ trong một chừng mực rất hạn chế. Khảnăng của nó sẽ bị giảm rất nhiều khi độ dài genon (bộ gen) lớn hơn 105% (51÷ 52kb) hoặc nhỏ hơn 78% (38 ÷ 38,5kb) so với độ dài ban đầu.Người ta tìm cách tăng chiều dài của đoạn được cài bằng cách giảm đi nhiềuhoặc ít chiều dài những phần không cần thiết của genon của phage λ. Trongsố các vector bỏ 1/3 phần trung tâm giữa gen J và N. Trong khi đó giữ lại đầu5’ (tay trái) vốn mã hoá cho protein đầu, đuôi. Cũng như đầu 3’ (tay phải)vốn mã hoá cho protein thiết yếu cho sự tái bản và chu kỳ tan. Phage λ biến hìnhPhần trung tâm giữa gen J và N không cần thiết cho sự sinh sản của phage cóthể được thay bằng DNA lạ. Các đầu mảnh 5’ và 3’ đều là đầu dính.Cài một mảnh của operon lacZ:AMục đích là chọn ra phage tái tổ hợp mà đem lại khả năn ...