Xác định sự hiện diện DNA thai tự do trong máu mẹ bằng kỹ thuật MSP kết hợp tạo dòng giải trình tự

Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Tách chiết cfDNA (DNA tự do) từ mẫu huyết tương của thai phụ. Bài viết trình bày việc ác định sự hiện diện của cffDNA thông qua sự khác biệt trạng thái methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xác định sự hiện diện DNA thai tự do trong máu mẹ bằng kỹ thuật MSP kết hợp tạo dòng giải trình tựNghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ BẰNG KỸ THUẬT MSP KẾT HỢP TẠO DÒNG GIẢI TRÌNH TỰ Lương Bắc An*,***, Lê Thị Xuân Thảo*, Nguyễn Khắc Hân Hoan**, Lê Quang Thanh**, Đỗ Thị Thanh Thủy*.TÓM TẮT Mở đầu: Phân tích DNA thai tự do (cffDNA) trong máu mẹ không chỉ hữu ích trong sàng lọc tiền sảnkhông xâm lấn (NIPS) một số bất thường lệch bộ nhiễm sắc thể như T21, T18, T13 mà còn hữu ích trongtầm soát một số bất thường liên kết giới tính, nhóm máu rhesus D (RhD),  -thalassemia, tăng sản tuyếnthượng thận bẩm sinh, loạn dưỡng cơ.... Tất cả những xét nghiệm này đều tập trung vào phát hiện nhữngtrình tự bất thường của thai nhi được di truyền từ bố mẹ. Thai nhi có thừa hưởng những trình tự bấtthường hay không được xác định bằng cách phân tích cffDNA trong huyết tương thai phụ. Tuy nhiên, kếtquả không phát hiện các trình tự bất thường có thể bị tác động bởi các yếu tố như hàm lượng cffDNA quáthấp hoặc cffDNA bị thoái hoá và thất thoát trong quá trình xử lí mẫu. Chính vì vậy, cần có một dấu ấn xácđịnh sự hiện diện của cffDNA trong huyết tương thai phụ cho phép kiểm soát các trường hợp âm tính giả. Mục tiêu: Xác định sự hiện diện của cffDNA thông qua sự khác biệt trạng thái methyl hoá vùngpromoter gen RASSF1A Phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Tách chiết cfDNA (DNA tự do) từ mẫu huyết tương củathai phụ. Mẫu cfDNA được xử lí bisulfite trước khi thực hiện phản ứng methylation specific PCR (MSP)để phát hiện cffDNA trong máu mẹ. Tạo dòng trình tự DNA của thai và DNA của mẹ vào vector. Giảitrình tự xác định các vị trí C-methyl hoá trong DNA thai. Kết quả: Phát hiện được sự hiện diện cffDNA trong máu mẹ thông qua sự methyl hoá promoter genRASSF1A. Tạo dòng thành công vector chứa trình tự DNA của thai và vector chứa trình tự DNA của mẹ.Kết quả giải trình tự cho thấy toàn bộ 14 vị trí C-methyl hoá trên vùng trình tự DNA của thai đều ở trạngthái methyl hoá. Kết luận: Methyl hoá vùng promoter gen RASSF1A được xem là một dấu ấn để phát hiện sự tồn tạicủa cffDNA. Dấu ấn này cho phép phát hiện được những kết quả âm tính giả trong các sàng lọc không xâmlấn sử dụng cffDNA để phân tích. Từ khóa: Methylation, RASSF1A, methylation specific PCR (MSP), cfDNA, cffDNA.ABTRACTS. IDENTIFICATION THE CIRCULATING FREE FETUS DNA IN MATERNAL BLOOD BY USING MSP COMBINES CLONING AND SEQUENCING TECHINIQUES. Luong Bac An, Le Thi Xuan Thao, Nguyen Khac Han Hoan, Le Quang Thanh, Do Thi Thanh Thuy. Ho Chi Minh City Journal of Medicine *Vol. 22 - No 4- 2018: 367 – 374. Introduction: Circulating fetal DNA analysis in maternal plasma is useful in the non-invasive prenatalscreening (NIPS) not only the detection of aneuplodies but also identification of sex-linked disorders, fetal rhesusD (RhD), B-thalassemia and aneuplodies. Many of these applications focus on the detection of paternally inheriteddisease-causing sequences in maternal plasma. Whether the fetus has inherited such a sequence is inferred by the * Đại học Y Dược TP. HCM, ** Bệnh viện Từ Dũ Tp. HCM, *** Đại học Khoa Học Tự Nhiên-Tp.HCM. Tác giả liên lạc: CN. Lương Bắc An ĐT: 0933.908.241 Email: luongbacan1991@gmail.com.368Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018 Nghiên cứu Y họcpresence or absence of the target sequence in maternal plasma, but the absence of such a sequence in maternalplasma could alternatively be a result of low cffDNA concentrations or cffDNA loss during samples processing.Thus, the availability of a positive control confirming the presence of fetal DNA in the sample would be avoidedfalse-negative results. Objectives: Identification of cffDNa in maternal blood through differently methylation status of RASSF1Apromoter. Methods: A cross-sectional study. CfDNA were extracted, then were treated bisulfate. MSP was carried outto detect cffDNA in maternal plasma. Cloning and sequencing the MSP products to identify the C-methylationbases. Results: we identified the presentation of fetal DNA in maternal blood through methylation of RASSF1Apromoter. We have successfully cloned the fetal DNA and maternal DNA into vector. All 14 CpG sites wasabsolute methylation in fetal DNA sequence. Conclusions: Hypermethylation RASSF1A is a universal marker for fetal DNA and is readily detectable inmaternal plasma. This marker allows the detection of false-negative results when applied to NIPS. Key words: Methylation, RASSF1A, methylation specific PCR (MSP), cfDNA, NIPS.ĐẶT VẤN ĐỀ. huyết ...